一种用于检测遗传易栓症相关基因SNP位点的检测试剂盒及使用方法与流程

本发明涉及基因检测，特别涉及一种用于检测遗传易栓症相关基因snp位点的检测试剂盒及使用方法。

背景技术：

1、易栓症最早是在1965年由egeberg在报道首例遗传性抗凝血酶ⅲ缺乏症伴血栓栓塞时提出的，意为血栓形成的倾向性增高。易栓症患者易形成深静脉血栓(deep veinthrombosis，dvt)以及肺栓塞(pulmonary embolism，pe)，两者可统称为静脉血栓栓塞(venous thromboembolism，vte)，易栓症的血栓栓塞类型主要为遗传易栓症。vte的发病危险因素分为遗传性和获得性因素，后者包括高龄、妊娠和分娩、久坐、制动、癌症、外伤/骨折、口服避孕药等，除此之外，临床上发现部分vte患者发病年龄较轻、无明显诱因、反复及多部位血栓形成或罕见部位血栓形成、家族中其他成员有类似的血栓性疾病病史等，提示存在遗传性易栓因素，遗传性易栓症的定义是患者本身存在基因缺陷，我国人群的遗传性易栓症危险因素以抗凝蛋白缺陷(包括抗凝血酶((antithrombin，at)、蛋白c和蛋白s缺陷)为主，此外，组织因子途径抑制物缺陷、凝血因子异常、富组氨酸糖蛋白血症和高同型半胱氨酸血症等也是遗传性易栓症的危险因素。由于遗传性血栓栓塞症占易栓症总体的30％-50％，且发病年龄主要涉及儿童及青壮年，育龄女性以妊娠为诱导因素也较为常见，其造成的严重性、危机性和后遗症不容忽视。

2、随着分子生物学的快速发展，基因变异在vte发病中起重要的决定作用，研究表明fⅺ基因、serpine1基因、fⅴ基因、fⅱ基因以及mthfr基因的相关snp位点与遗传性易栓症有密切关系，fⅴc.1601g>a会导致凝血因子缺陷，引起活化蛋白c抵抗；fⅱc.*97g>a会导致凝血因子缺陷，引起凝血酶原水平升高；serpine1 c.-820-819insg使得纤溶蛋白缺陷，引起纤溶酶原活化抑制物-1(pai-1)增多；mthfr c.677c>t、mthfr c.1298a>c可引起同型半胱氨酸水平升高，增加了患血栓的风险；fⅺc.1481-188c>t导致凝血因子f11水平升高，在亚洲人群中，fⅺ突变的发生率占比0.3，serpine1 c.-820-819insg突变的发生率占比0.5，mthfr c.677c>t突变的发生率占比0.3，mthfr c.1298a>c突变的发生率占比0.2，蛋白c、蛋白s和抗凝血酶缺陷的总发生率分别为1.15％、1.49％和2.29％。因此，通过对个体进行相关易栓症基因的筛查和风险预测，实现精准个体化用药具有重要的价值和意义。

3、近年基因检测技术的发展为临床对个体易栓症基因的筛查带来了便捷，如文献号cn114214402a中国专利公开了血液高凝或静脉血栓风险基因多态性检测引物组、试剂盒及检测方法和应用，其采用sanger测序法对血液高凝或静脉血栓风险基因多态性位点进行了检测，虽然基因测序法是检测snp或突变的金标准，具备高通量、多位点的优势，但也存在步骤繁琐，试验周期长，成本高，效率低等问题，不利于临床大面积推广的缺点。再如文献号cn107557466a中国专利公开了血栓病易感基因联合检测试剂盒及其基因芯片检测法，涉及基因芯片检测技术，该试剂盒需要经过样本采集、芯片洗脱液配制、样本处理、pcr扩增及标记、杂交、洗脱和扫描及结果判定七个步骤，操作过程繁琐，难以实现批量化与自动化，芯片要求高，仪器成本高，无法检测未知突变。

4、遗传易栓症遗传原因包括几种不同凝血、抗凝剂或溶栓因子中任何一种的多态性，例如因子v基因(因子v leiden(fvl)变体)、凝血酶原基因(因子ii)和亚甲基四氢叶酸还原酶基因(mthfr)。其他可能的遗传原因是因子viii、ix或xi或纤维蛋白原基因的表达水平增加。然而现有的检测试剂盒通常检测mthfr基因、fⅴ基因的相关snp位点，仅涵盖其中的某一种或几种多态性检测。因此，我们从不同的遗传机制出发，结合现有的中国人群的血栓性疾病遗传因素研究基础，选择涵盖绝大多数遗传易栓症遗传原因的相关snp位点，如fⅺ基因、serpine1基因、fⅴ基因、fⅱ基因以及mthfr基因进行同时检测，开发一种操作简单、特异性强、灵敏度高、可靠性强且成本低的检测方案。

技术实现思路

1、本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种用于检测遗传易栓症相关基因snp位点的检测试剂盒及使用方法，以解决现有技术问题存在的不足。

2、本发明采用的技术方案如下：一种用于检测遗传易栓症相关基因snp位点的检测试剂盒，它包括：pcr检测试剂1、pcr检测试剂2、pcr检测试剂3、pcr检测试剂4以及用于释放待测样本基因组dna的样本稀释液；

3、所述pcr检测试剂1包括用于检测检测mthfr c.677c>t、mthfr c.1298a>c和fⅺc.1481-188c>t位点的野生型引物探针组；

4、所述pcr检测试剂2包括用于检测mthfr c.677c>t、mthfr c.1298a>c和fⅺc.1481-188c>t位点的突变型引物探针组；

5、所述pcr检测试剂3包括用于检测检测serpine1 c.-820-819insg、fⅴc.1601g>a位点的野生型引物探针组，fⅱc.*97g>a位点的突变型引物探针组；

6、所述pcr检测试剂4包括用于检测serpine1 c.-820-819insg、fⅴc.1601g>a位点的突变型引物探针组，fⅱc.*97g>a野生型引物探针组。

7、在上述检测试剂盒中，检测试剂3和检测试剂4中设计了2种不同的反应体系，检测试剂3和4中均包含了野生型引物探针组以及突变型引物探针组，发明人发现，检测试剂3和4中为单一反应体系时，容易发生因多重pcr中的不同扩增片段互相竞争资源，单孔目标基因过多，导致某通道扩增曲线存在被压制情况，而构建2种不同的反应体系后，则很好的规避了该问题。

8、进一步，所述pcr检测试剂1、pcr检测试剂2、pcr检测试剂3、pcr检测试剂4中还包含：用于检测rpph内参基因的引物探针组。

9、进一步，所述pcr检测试剂1、pcr检测试剂2、pcr检测试剂3、pcr检测试剂4的引物序列见表1所示：

10、表1特异性引物探针序列表

11、

12、

13、其中，所述用于检测mthfr c.677c>t位点的野生引物探针组包括序列如seq idno.1所示的正向野生引物、序列如seq id no.3所示的反向公用引物，序列如seq id no.4所示的探针；

14、所述用于检测mthfr c.1298a>c位点的野生引物探针组包括序列如seq id no.5所示的正向野生引物、序列如seq id no.7所示的反向公用引物，序列如seq id no.8所示的探针；

15、所述用于检测fⅴc.1601g>a位点的野生引物探针组包括序列如seq id no.9所示的反向野生引物、序列如seq id no.11所示的正向公用引物，序列如seq id no.12所示的探针；

16、所述用于检测serpine1 c.-820-819insg位点的野生引物探针组包括序列如seqid no.13所示的正向野生引物、序列如seq id no.15所示的反向公用引物，序列如seq idno.16所示的探针；

17、所述用于检测fⅺc.1481-188c>t位点的野生引物探针组包括序列如seq idno.17所示的正向野生引物、序列如seq id no.19所示的反向公用引物，序列如seq idno.20所示的探针；

18、所述用于检测fⅱc.*97g>a位点的野生引物探针组包括序列如seq id no.21所示的正向野生引物、序列如seq id no.23所示的反向公用引物，序列如seq id no.24所示的探针；

19、所述用于检测mthfr c.677c>t位点的突变引物探针组包括序列如seq id no.2所示的正向突变引物、序列如seq id no.3所示的反向公用引物，序列如seq id no.4所示的探针；

20、所述用于检测mthfr c.1298a>c位点的突变引物探针组包括序列如seq id no.6所示的正向突变引物、序列如seq id no.7所示的反向公用引物，序列如seq id no.8所示的探针；

21、所述用于检测fⅴc.1601g>a位点的突变引物探针组包括序列如seq id no.10所示的反向突变引物、序列如seq id no.11所示的正向公用引物，序列如seq id no.12所示的探针；

22、所述用于检测serpine1 c.-820-819insg位点的突变引物探针组包括序列如seqid no.14所示的正向突变引物、序列如seq id no.15所示的反向公用引物，序列如seq idno.16所示的探针；

23、所述用于检测fⅺc.1481-188c>t位点的突变引物探针组包括序列如seq idno.18所示的正向突变引物、序列如seq id no.19所示的反向公用引物，序列如seq idno.20所示的探针；

24、所述用于检测fⅱc.*97g>a位点的突变引物探针组包括序列如seq id no.22所示的正向突变引物、序列如seq id no.23所示的反向公用引物，序列如seq id no.24所示的探针；

25、所述检测内参基因的引物探针组包括序列如seq id no.25所示的正向引物、序列如seq id no.26所示的反向引物以及序列如seq id no.27所示的探针。

26、进一步，所述探针采用taqman荧光探针，探针序列5'端标记荧光报告基团，3'端标记荧光淬灭基团。例如探针的5'端用fam、texas red、hex荧光染料中的任意一种进行标记；探针的3'端用bhq1或bhq2荧光染料中的任意一种进行标记。

27、进一步，检测mthfr c.677c>t基因位点的探针采用fam荧光染料标记，3'端采用bhq1或者bhq2荧光染料标记；

28、检测mthfr c.1298a>c基因位点的探针采用texas red荧光染料标记，3'端采用bhq1或者bhq2荧光染料标记；

29、检测fⅺc.1481-188c>t基因位点的探针采用hex荧光染料标记，3'端采用bhq1或者bhq2荧光染料标记；

30、检测serpine1c.-820-819insg基因位点的探针采用fam荧光染料标记，3'端采用bhq1或者bhq2荧光染料标记；

31、检测fⅱc.*97g>a基因位点的探针采用hex荧光染料标记，3'端采用bhq1或者bhq2荧光染料标记；

32、检测fⅴc.1601g>a基因位点的探针采用texas red荧光染料标记，3'端采用bhq1或者bhq2荧光染料标记；

33、检测rpph基因位点的探针采用cy5荧光染料标记，3'端采用bhq1或者bhq2荧光染料标记。

34、进一步，所述pcr检测试剂1、pcr检测试剂2、pcr检测试剂3、pcr检测试剂4中还包含pcr反应液，所述pcr反应液包含taq酶、tris-hcl、mgcl2、dntps和buffer。

35、进一步，所述pcr反应液中还包含：质量浓度为0.5％-0.7％的taq酶抗体、30ng-50ng的ssb、质量浓度为1％的甲酰胺、质量浓度为0.2％-0.25％的bsa。

36、进一步，所述检测试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照包含所有目标基因靶序列多态性位点的dna重组质粒；所述阴性对照包括生理盐水。

37、进一步，所述样本稀释液包括sds、甲酰胺、hcl。

38、进一步，本发明还包括一种检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

39、a、采用样本稀释液释放待测样本的dna；

40、b、在所述pcr检测试剂1、pcr检测试剂2、pcr检测试剂3、pcr检测试剂4中直接加入步骤a的dna提取物进行充分混匀；

41、c、荧光定量pcr扩增反应程序为：

42、预变性反应：97℃反应3min；

43、扩增反应：97℃反应12s，60℃反应45s，45个循环；

44、d、待测样本基因型判定。

45、综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

46、1、本发明的检测试剂盒通过在预混形式的pcr反应液中添加由taq酶抗体、ssb、甲酰胺、bsa混合而成的促进剂，改善了多重荧光pcr反应体系中靶标基因的扩增效率和灵敏度，可准确检测dna含量低至0.5ng的全血样本；

47、2、本发明的检测试剂盒通过设置装有预混形式的pcr检测试剂1、pcr检测试剂2、pcr检测试剂3和pcr检测试剂4，提供了一种简便且稳定的预分装方式，免除了pcr扩增体系配制步骤，操作更加便捷，减少了操作误差，方便用户使用；

48、3、本发明的试剂盒的检测技术方法相对于市面上其它检测方法，极大地简化了操作强度，可实现1小时左右出结果，并且大大降低了成本；可在同一反应体系中同时检测3个靶标基因和一个内标基因，检测结果容易判读，为临床遗传性易栓症风险预测提供了可靠参考。