用于检测绵羊布鲁氏菌病抗性的SNP分子标记及其检测引物和应用

本发明涉及分子标记辅助育种，尤其涉及用于检测绵羊布鲁氏菌病抗性的snp分子标记及其检测引物和应用。

背景技术：

1、布鲁氏杆菌病（brucellosis）简称布病，是由布鲁氏菌引起的人畜共患性全身传染病，其临床症状包括波浪热、关节炎和繁殖障碍（公畜睾丸炎和附睾炎，母畜流产和不孕）等。布鲁氏菌具有免疫逃避和隐性感染的特性，其中羊种布鲁氏菌的毒力和感染性最强，不仅对绵羊养殖业造成巨大经济损失，还成为公共卫生的重大安全隐患。在宿主动物绵羊中挖掘与抗布鲁氏菌病性状相关的分子标记，并应用于辅助绵羊的抗病育种，不仅能从根本上切断布鲁氏菌病的传播途径，还能减轻因抗生素滥用而造成的环境污染和药物残留危害。因此挖掘绵羊的抗布鲁氏菌病相关分子标记具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明提供用于检测绵羊布鲁氏菌病抗性的snp分子标记及其检测引物和应用。

2、本发明通过在不同品种绵羊中进行全基因组关联分析，发现了绵羊基因组中与布鲁氏菌病抗性性状相关的snp分子标记，通过大样本量的绵羊群体验证，证明该snp分子标记与绵羊布鲁氏菌病抗性性状存在显著相关性，可用于检测绵羊对布鲁氏菌病的抗性高低。为便于检测，本发明还开发了用于检测该snp分子标记的引物组合。

3、基于上述发现，本发明提供以下技术方案：

4、第一方面，本发明提供与绵羊布鲁氏菌病抗性相关的snp分子标记，所述snp分子标记含有如seq id no.1所示序列第101位的多态性为g/a的核苷酸序列。

5、以上所述的snp分子标记的多态性位点位于版本号为oar_v1.0，2017年11月的绵羊参考基因组的第3号染色体第35698759位，多态性为g/a。

6、上述snp分子标记与绵羊对布鲁氏菌病的抗性高低存在显著相关性，能够针对不同品种绵羊较为准确地鉴定其对布鲁氏菌病的抗性，用于绵羊抗布鲁氏菌病的分子标记辅助育种和品种改良，提高分子育种效率。

7、基于上述版本号为oar_v1.0，2017年11月的绵羊参考基因组的第3号染色体第35698759位的多态性位点，为便于检测，本发明针对该多态性位点的上下游序列开发了snp分子标记序列片段以及用于扩增该snp分子标记的引物。结合该多态性位点的上下游序列，本发明获得了seq id no.1所示序列。本领域技术人员可以理解的是，基于上述snp位点及其上下游序列可开发不同长度的序列片段作为snp分子标记，因此seq id no.1所示序列并不构成对本发明的snp分子标记的限制，只要包含版本号为oar_v1.0，2017年11月的绵羊参考基因组的第3号染色体第35698759位的多态性位点的序列片段均在本发明的snp分子标记的保护范围内。

8、在本发明的一些实施方式中，所述snp分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，多态性位点位于如seq id no.1所示序列的第101位，多态性为g/a。

9、seq id no.1：

10、tgttttgctttctctttccttccatcttttcttgcccaggtcacccagctaaggaatggccaaatcagctgggactctgccctttcgctggagctggggaragaaggtccctaggaggtagggaccagcccctcagccttatccctccccttctctgccaggtcctggggagtccgagaagatccagcagctggaagagca。其中，r为snp分子标记的多态性位点，r=g或a。

11、在本发明的一些实施方式中，以上所述的snp分子标记为以绵羊基因组为模板、由序列如seq id no.2-4所示的引物扩增得到。

12、以上所述的snp分子标记的多态性位点的基因型为gg或aa，对应于布鲁氏菌病高抗性，基因型为ga，对应于布鲁氏菌病低抗性。

13、上述snp分子标记中，相较“ga”杂合基因型，“gg”纯合基因型和“aa”纯合基因型的绵羊具有更强的布鲁氏菌病抗性。

14、第二方面，本发明提供一种引物组合，所述引物组合用于扩增以上所述的与绵羊布鲁氏菌病抗性相关的snp分子标记。

15、根据以上提供的snp分子标记的多态性位点所在基因组的位置及其上下游序列，本领域技术人员可以开发用于扩增该snp分子标记的各种类型的引物。

16、上述引物可以为任何能够用于检测snp分子标记基因型的引物。

17、优选地，所述引物组合包括序列如seq id no.2-4所示的引物，其中序列如seq idno.2-3所示的引物为正向引物，序列如seq id no.4所示的引物为反向通用引物。

18、seq id no.2：5’-cctacctcctagggaccttctt-3’；

19、seq id no.3：5’-ctacctcctagggaccttctc-3’；

20、seq id no.4：5’- tcacccagctaaggaatggccaaat -3’。

21、以上所述的引物组合能够针对上述snp分子标记实现高效的扩增和基因分型。

22、kasp，即竞争性等位基因特异性pcr，该技术可通过特异性荧光探针进行snp的高精度双等位基因分型，且分析稳定准确、成本低、效率高，易于实现高通量和自动化。因此，为实现高效检测，本发明基于kasp技术开发了用于检测上述snp分子标记的kasp引物组合。

23、优选地，所述kasp引物组合包括第一正向引物、第二正向引物以及反向通用引物，其中，所述第一正向引物的序列为顺次连接的特异性荧光标签序列以及seq id no.2所示序列，第二正向引物的序列为顺次连接的特异性荧光标签序列以及seq id no.3所示序列；反向通用引物的核苷酸序列如seq id no.4所示。

24、以上所述的第一正向引物和第二正向引物的荧光标签不同。

25、在本发明的一些实施方式中，所述引物组合包含seq id no.5-6所示的正向引物以及seq id no.4所示的反向通用引物。

26、第三方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含以上所述的引物组合。

27、为便于检测，所述试剂盒还可包含其他用于pcr扩增的试剂，包括但不限于dna聚合酶、pcr反应缓冲液、探针、dntp、mg2+、水等。

28、上述试剂可单独包装或经混合后作为预混液提供。

29、以上所述的试剂盒可具有以下任一种用途：

30、1）检测或辅助检测绵羊对布鲁氏菌病抗性高低；

31、2）筛选或鉴定高抗布鲁氏菌病的绵羊；

32、3）绵羊抗布鲁氏菌病性状的早期预测；

33、4）绵羊对布鲁氏菌病抗性的分子标记辅助育种；

34、5）绵羊对布鲁氏菌病抗性的品种改良。

35、第四方面，本发明提供snp分子标记或所述snp分子标记的检测引物的以下1）-8）中的任意一种应用：

36、1）在检测或辅助检测绵羊对布鲁氏菌病抗性高低中的应用；

37、2）在制备用于检测或辅助检测绵羊对布鲁氏菌病抗性高低的试剂中的应用；

38、3）在筛选或鉴定高抗布鲁氏菌病的绵羊中的应用；

39、4）在制备用于筛选或鉴定高抗布鲁氏菌病的绵羊的试剂中的应用；

40、5）在绵羊抗布鲁氏菌病性状的早期预测中的应用；

41、6）在制备用于绵羊抗布鲁氏菌病性状的早期预测试剂中的应用；

42、7）在绵羊对布鲁氏菌病抗性的分子标记辅助育种中的应用；

43、8）在绵羊对布鲁氏菌病抗性的品种改良中的应用。

44、所述snp分子标记的多态性位点位于版本号为oar_v1.0，2017年11月的绵羊参考基因组的第3号染色体第35698759位，多态性为g/a。

45、在本发明的一些实施方式中，上述应用中，所述snp分子标记含有如seq id no.1所示序列第101位的多态性为g/a的核苷酸序列。

46、在本发明的一些实施方式中，上述应用中，所述snp分子标记的核苷酸序列如seqid no.1所示，多态性位点位于如seq id no.1所示序列的第101位，多态性为g/a。

47、在本发明的一些实施方式中，上述应用中，所述snp分子标记的检测引物包括序列如seq id no.2-4所示的引物，其中序列如seq id no.2-3所示的引物为正向引物，序列如seq id no.4所示的引物为反向通用引物。

48、上述应用中，所述snp分子标记的多态性位点的基因型为gg或aa，对应于布鲁氏菌病高抗性，基因型为ga，对应于布鲁氏菌病低抗性。

49、上述应用中，选择所述snp分子标记的基因型为“gg”和“aa”的绵羊作为亲本进行抗布鲁氏菌病性状育种。

50、第五方面，本发明提供一种检测绵羊对布鲁氏菌病抗性的方法，所述方法包括：检测绵羊基因组中与绵羊抗布鲁氏菌病性状相关的snp分子标记的基因型，所述snp分子标记的多态性位点位于版本号为oar_v1.0，2017年11月的绵羊参考基因组的第3号染色体第35698759位，多态性为g/a。

51、所述snp分子标记的多态性位点的基因型为gg或aa，对应于布鲁氏菌病高抗性，基因型为ga，对应于布鲁氏菌病低抗性。

52、在本发明的一些实施方式中，所述snp分子标记含有如seq id no.1所示序列第101位的多态性为g/a的核苷酸序列。

53、在本发明的一些实施方式中，所述snp分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，多态性位点位于如seq id no.1所示序列的第101位，多态性为g/a。

54、优选地，所述方法包括如下步骤：

55、1）提取待检测绵羊的基因组dna；

56、2）以步骤1）的基因组dna为模板，利用序列如seq id no.2-4所示的引物进行pcr扩增；

57、3）分析pcr扩增产物中所述snp 分子标记的基因型，根据基因型判断待检测绵羊对布鲁氏菌病的抗性高低，若所述snp分子标记的多态性位点的基因型为gg或aa，则判断为布鲁氏菌病高抗性，若基因型为ga，则判断为布鲁氏菌病低抗性。

58、本发明的有益效果至少包括：本发明提供与绵羊布鲁氏菌病抗性性状相关的snp分子标记，该snp分子标记与绵羊布鲁氏菌病抗性显著相关，能够较为准确地检测绵羊对布鲁氏菌病的抗性高低，可实现绵羊抗布鲁氏菌病性状的早期预测，不受绵羊的年龄、性别等限制，甚至绵羊刚出生即可进行准确筛选，可用于抗布鲁氏菌病绵羊的选育和绵羊抗布鲁氏菌病性状的分子标记辅助育种，能够显著促进抗布鲁氏菌病绵羊选育的育种进程，有效提高育种效率，对开发和利用绵羊优良品种的优良经济特性及保护和合理地利用品种资源具有重要意义。