一种用于药物用药基因多态性检测的组合物、试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及分子诊断，特别是涉及一种用于药物用药基因多态性检测的组合物、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、嘌呤类药物属于抑制嘌呤合成途径的细胞周期特异性药物，化学结构与次黄嘌呤相似，因而能竞争性地抑制次黄嘌呤的转变过程。6-巯基嘌呤(mercaptopurine，6-mp)是腺嘌呤6位上的-nh2被-sh取代的衍生物。在体内先经过酶的催化变成硫基次黄嘌呤单磷酸盐(thioinosine monophosphate，timp)后，阻止肌苷酸转变为腺核苷酸及鸟核苷酸，干扰嘌呤代谢，阻碍核酸合成，对s期细胞作用最为显著，对g1期有延缓作用。肿瘤细胞对6-mp产生耐药性是由于耐药细胞中6-mp不易转变成timp或产生后迅速降解。6-mp起效慢，主要用于急性淋巴细胞白血病的维持治疗，大剂量对绒毛膜上皮癌亦有较好疗效。常见骨髓抑制和消化道粘膜损害，少数患者可出现黄疸和肝功能损伤。

2、硫嘌呤s-甲基转移酶(thiopurine s-methyltransferase，tpmt)是一种非金属依赖性酶，在硫嘌呤类药物的体内代谢中起着重要作用。硫嘌呤类药物在临床上用于急性白血病和一些自身免疫疾病的治疗，tpmt的活性与这类药物的临床疗效和毒性密切相关。tpmt酶活性分布存在多态性现象，tpmt遗传变异是导致其酶活性降低的主要原因。正常活性的tpmt由tpmt*1等位基因编码，tpmt*2(rs1800462，c.238g>c，p.ala80pro)、tpmt*3a(rs1800460，c.460g>a，p.ala154thr；rs1142345，c.719a>g，p.tyr240cys)、tpmt*3b(rs1800460，c.460g>a，p.ala154thr)、tpmt*3c(rs1142345，c.719a>g，p.tyr240cys)是导致tpmt活性下降的主要snp或单倍型。fda已批准在6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤和硫唑嘌呤的药品说明书中增加在用药前进行tpmt基因多态性检测的建议。

3、鸟嘌呤核苷三磷酸酶(mutt homolog 2，mth2)是一种基因修复蛋白，属于水解酶超家族，是由nudt15(mth2)基因表达得到的。该酶可以水解8氧鸟嘌呤脱氧核苷三磷酸(8-oxo-7,8-dihydro-2-deoxyguanosine 5-triphosphate，8-oxo-dgtp)为8-oxo-dgmp，从而抑制dna氧化加成物的生成和变异的产生。在巯基嘌呤代谢中将有活性的thio-gtp转化成无活性成分thio-gmp。nudt15基因415位点上的胞嘧啶由胸腺嘧啶取代(即c.415c>t，rs116855232)，从而导致第139密码子上精氨酸(arg)由半胱氨酸(cys)取代，该突变使nudt15酶活性降低，进而使巯基嘌呤类药物，如硝基咪唑嘌呤、6-巯基嘌呤等的毒副作用大大增加，仅耐受标准剂量的8％。nudt15基因416位点上的鸟嘌呤由腺嘧啶取代(即c.416g>a，rs147390019)，从而导致第139密码子上精氨酸(arg)由组氨酸(his)取代，该突变使nudt15酶活性低于正常水平的80倍进而使巯基嘌呤类药物，如硝基咪唑嘌呤、6-巯基嘌呤等的毒副作用增加，临床慎用。

4、药物用药基因多态性检测的常用方法有：pcr-rflp、sanger测序法、实时荧光定量pcr法等。pcr-rflp通过限制性核酸内切酶切片段长度多态性揭示dna碱基序列组成的异同，是最早用于基因分型的经典方法之一，现在仍被临床广泛采用。具有灵敏度较高，对扩增产物纯度要求不苛刻，无需特别的仪器设备，成本低，可重复性强等特点，但主要以手工操作为主，受通量限制，工作量较大，不利于大样本检测，且只适合部分单核苷酸多态性分型。sanger法测序，也称直接测序法，是dna序列分析的经典方法，被公认为是基因分型的金标准。该法可从仪器上直接读取dna序列，但基因测序仪昂贵，对实验室环境、操作技术，扩增产物纯度等要求较高，大规模临床应用受限，不易普及。实时荧光定量pcr法利用不同等位基因标记的荧光染料性质差异，通过检测特定的荧光信号来判断基因分型，灵敏度高，结果准确，操作简便，但常规的taqman探针法受仪器通道限制，无法实现在单管条件下，大于4个以上靶点的检测需求。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种用于药物用药基因多态性检测的组合物、试剂盒及其应用。本发明所述组合物在单管条件下，可同时检测5个基因位点。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供了一种用于药物用药基因多态性检测的组合物，包括：检测rs1800462的引物探针组、检测rs1800460的引物探针组、检测rs1142345的引物探针组、检测rs116855232的引物探针组和检测rs147390019的引物探针组；

4、所述检测rs1800462的引物探针组中的上游引物238f、下游引物238r和阻断修饰荧光探针238p的核苷酸序列如seq id no.1～3所示；所述检测rs1800460的引物探针组中的上游引物460f、下游引物460r和阻断修饰荧光探针460p的核苷酸序列如seq id no.4～6所示；检测rs1142345的引物探针组中的上游引物719f、下游引物719r和阻断修饰荧光探针719p的核苷酸序列如seq id no.7～9所示；检测rs116855232的引物探针中的上游引物415f、下游引物415r和阻断修饰荧光探针415p的核苷酸序列如seq id no.10～12所示；检测rs147390019的引物探针组中的上游引物416f、下游引物416r和阻断修饰荧光探针416p的核苷酸序列如seq id no.13～15所示。

5、优选的，所述阻断修饰荧光探针均修饰有荧光基团和猝灭基团。

6、优选的，所述荧光基团包括fam、vic、hex、rox和cy5中的一种，猝灭基团包括mgb、super quencher 1、bhq1、bhq2和bhq3中的一种。

7、本发明提供了一种用于药物用药基因多态性多重检测的试剂盒，所述试剂盒包括引物探针体系；所述引物探针体系包括上述的组合物、tris-hcl、edta和proclin 950。

8、优选的，所述引物探针体系中上游引物、下游引物和阻断修饰荧光探针的工作浓度均独立为0.01-1μm，tris-hcl的工作浓度为10-50mm，edta的工作浓度为0.1～1mm，proclin 950的体积百分含量为0.005％～5％。

9、优选的，所述引物探针体系中上游引物、下游引物和阻断修饰荧光探针的工作浓度均独立为0.1～0.3μm，tris-hcl的工作浓度为15mm，edta的工作浓度为0.2mm，proclin950的体积百分含量为0.025％。

10、优选的，所述试剂盒还包括反应缓冲液；所述反应缓冲液包括tris-hcl、dntps、mut-taq dna聚合酶、ung/udg酶、mgcl2、kcl、甘油和proclin 950。

11、优选的，所述反应缓冲液中tris-hcl的工作浓度为10-50mm，dntps的工作浓度为0.1-1mm，mut-taq dna聚合酶的酶活为1-5u/反应，ung/udg酶的酶活为0.2-2u/反应，mgcl2的工作浓度为1.5-5mm，kcl的工作浓度为10-80mm；所述反应缓冲液中甘油的体积百分含量为1％～15％，proclin 950的体积百分含量为0.005％～5％。

12、本发明提供了上述组合物或上述试剂盒在检测药物用药基因多态性中的应用。

13、本发明提供了一种药物用药基因多态性检测的方法，包括：

14、以待测样品的dna为模板dna，与上述组合物或上述试剂盒中的引物的混合进行pcr并进行多色熔解曲线检测分析pcr产物。

15、本发明公开了以下技术效果：

16、本发明提供了一种用于药物用药基因多态性检测的组合物，包括：检测rs1800462的引物探针组、检测rs1800460的引物探针组、检测rs1142345的引物探针组、检测rs116855232的引物探针组和检测rs147390019的引物探针组；所述检测rs1800462的引物探针组中的上游引物238f、下游引物238r和阻断修饰荧光探针238p的核苷酸序列如seq idno.1～3所示；所述检测rs1800460的引物探针组中的上游引物460f、下游引物460r和阻断修饰荧光探针460p的核苷酸序列如seq id no.4～6所示；检测rs1142345的引物探针组中的上游引物719f、下游引物719r和阻断修饰荧光探针719p的核苷酸序列如seq id no.7～9所示；检测rs116855232的引物探针中的上游引物415f、下游引物415r和阻断修饰荧光探针415p的核苷酸序列如seq id no.10～12所示；检测rs147390019的引物探针组中的上游引物416f、下游引物416r和阻断修饰荧光探针416p的核苷酸序列如seq id no.13～15所示。本发明所述组合物在单管条件下，可同时检测5个基因位点。

17、本发明还提供了一种用于药物用药基因多态性多重检测的试剂盒，该试剂盒采用新型多色熔解曲线法，在单管条件下，可同时检测5个基因位点。因此，该试剂盒可提供tpmt基因的4种变异等位基因和nudt15基因的2种变异等位基因信息。而且本发明的试剂盒组分包括引物与探针混合液和反应缓冲液。其引物与探针混合液中的阻断修饰荧光探针，在不存在错配的情况下，与dna模板结合稳定性强于常规核苷酸探针与dna模板；在错配情况下，阻断修饰荧光探针与dna模板结合稳定性弱于常规核苷酸探针与dna模板。因此，单个碱基错配，阻断修饰荧光探针相比常规核苷酸探针具有更大的熔解温度差，从而更有利于区分杂合突变型。此外本发明的试剂盒涉及的所有探针均为单端茎环结构探针(见图1)，通过引入随机碱基和发卡结构设计，增强了探针对于野生型和突变型的检测区分度，进一步提高了试剂盒检测特异性。此外，引物与探针混合液中的引物组分，采用不对称组合方案，在满足灵敏度的基础上，可进一步降低探针的降解可能。本发明的反应缓冲液包含mut-taq dna聚合酶和ung-dutp组合，mut-taq dna聚合酶为优选的taq dna聚合酶突变体，其具有高效的抗阻遏延伸性能和弱5′-3′外切酶活性，因此可有效降低探针的降解比例，提高熔解信号强度。ung-dutp可为本发明提供更强的防污染能力，可有效降低假阳性。本发明具体实施例的结果表明：阻断修饰荧光探针相比于常规核苷酸探针，具有耐核酸外切酶降解特性，因此可有效提高熔解信号强度。同时本发明所述试剂盒的检测结果与sanger法测序结果相一致，检测限为1.5265ng，且tm值的变异系数均小于5％，因此，本发明所述试剂盒能够准确鉴定tpmt基因的4种变异等位基因和nudt15基因的2种变异等位基因信息。