富含β葡聚糖的灰树花碱提多糖的制备及应用

本发明涉及灰树花多糖提取，具体涉及一种富含β葡聚糖的灰树花碱提多糖的制备及应用。

背景技术：

1、灰树花(grifola frondosa)是一种原产自中国的食药两用真菌，属于多孔菌科，树花属，俗称“舞茸”，主要分布在欧洲、北美洲、日本和中国。在中国的传统中药中，灰树花被认为是一种具有补气健脾功效的药用真菌。在日本传统医学中，灰树花同样具有重要的地位，古书籍中有记载，其味道鲜美甘甜，可润肺护肝，增强体质。

2、灰树花子实体含有多种生物活性物质，包括蛋白质、多糖、甾类化合物、酚类化合物、矿物质和维生素等，此外，其脂质和热量水平较低，深受广大消费者的喜爱。其中，灰树花子实体多糖含量较高，在子实体和菌丝体干重中含量能达到30％～50％，同时灰树花多糖(grifola frondosa polysaccharides，gfp)也是灰树花中最主要的活性物质。

3、现阶段，关于灰树花多糖的提取方法较多。灰树花提取物现有提取技术有水提法、碱提法、酶提法、超声波辅助法和微波辅助法等。其中，水提法因取材来源广泛，对实验设备要求低，是应用最多的提取方法。但水浸提后生成了大量残渣，这些残渣常作为肥料甚至废料，造成了资源浪费和环境压力。而残渣中残存有大量不溶性多糖，仍有待利用空间，但目前的研究并未针对残渣再利用展开。

技术实现思路

1、本发明是为了克服现有技术中水提后灰树花废渣利用率低的缺陷，提供了一种富含β葡聚糖的灰树花碱提多糖的制备及应用以克服上述缺陷。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明的第一个目的在于，提供了一种富含β葡聚糖的灰树花碱提多糖制备方法，包括以下步骤：

4、s1、取灰树花子实体干品，用乙醇浸泡进行脱脂处理；

5、s2、脱脂处理后的灰树花子实体沸水浸提后离心收集废渣；

6、s3、在s2中得到的废渣中加入碱液在50～60℃下碱提4～5h，再次离心收集沉淀用酸液调节ph至7.0，透析去除盐离子后，旋蒸浓缩并用乙醇沉淀，收集沉淀冻干后加水复溶再冻融，收集冷水不溶物即得到富含β葡聚糖的灰树花碱提多糖。

7、本发明的申请人收集水浸提后生成的灰树花废渣，对其进行再次碱提提取废渣中的不溶性多糖。

8、具体操作为，对灰树花子实体进行脱脂处理，去除灰树花子实体中的脂类化合物进行水提，为保证快速除去灰树花子实体中大量的α-葡聚糖，采用了沸水提的方式，利用高温快速溶出α-葡聚糖，完成实验的前序步骤。

9、完成初步的水提之后，将水提完成后得到的废渣收集起来进行第二次的碱提处理。由于灰树花中大量的可溶性多糖都在水提后被富集至上清液中，废渣中剩余的不溶性多糖需要碱性溶剂的引发帮助其更好地释放。因而针对废渣中的多糖提取，本发明人选用了碱提的方式。碱性溶剂可以改变多糖的溶解性质，使其从不溶性状态转变为可溶性状态。碱性溶剂的高ph值能够解离多糖中的酸性基团，从而增加其溶解度。此外，由于废渣中残留的不溶性多糖含量并不高，选用低温碱提的方式延长提取时间能更好地提取得到尽量多的多糖。较低的温度有助于减少多糖的热解和降解，保持多糖的活性和稳定性。同时，温度的降低也有利于减少多糖与溶剂的反应速率，使得多糖更容易被提取。较长的提取时间有助于溶解不溶性多糖，使其与碱性溶剂相互作用并转化为可溶性形式。

10、继而，完成碱提后对沉淀进行各项处理最终收集得到冷水不溶物，测定其中各项组分含量，发现含有60％以上的β-葡聚糖和不到2％的α-葡聚糖，多糖含量89.29％。由此可证明按照本发明人提出的提取方法可对水浸提后生成的灰树花废渣进行再提取得到富含β葡聚糖的灰树花碱提多糖，完成了对灰树花废渣的有效利用。

11、优选地，所述步骤s1中，乙醇为体积浓度95～100％的乙醇水溶液。

12、高纯度的乙醇可帮助灰树花碱提多糖的快速溶出，缩短前序实验时间。

13、优选地，所述步骤s2中，沸水浸提的时间6h，重复2～3次。

14、多次沸水浸提可帮助灰树花中的可溶性多糖尽可能被释出，防止后续废渣提取时的结果受到干扰。

15、进一步优选地，所述步骤s2中，沸水浸提中去离子水和灰树花的重量比为15:1。

16、优选地，所述步骤s3中，碱液为1m的氢氧化钠溶液，废渣与氢氧化钠溶液的质量比为1:8。

17、氢氧化钠是一种碱性溶剂，具有较高的ph值，可以改变多糖的溶解性质，使其从不溶性状态转变为可溶性状态。而其与废渣的比值以确保废渣中的成分完全被氢氧化钠反应为主，因而在氢氧化钠溶液的用量上是大大高于废渣质量的，经过本发明人的多次验证，发现废渣与氢氧化钠溶液的质量比为1:8即可实现废渣中成分的完全溶解，当再增大氢氧化钠用量时，对废渣成分的提取率帮助不大，反而会使得后续过碱溶液处理成本增加。因而，出于实验效用考虑，控制在废渣与氢氧化钠溶液的质量比为1:8是最佳比。但当氢氧化钠的摩尔浓度发生改变时，相应比例也会变化，这里主要是针对氢氧化钠的实际用量出发进行考虑设计比例。

18、优选地，所述步骤s3中，碱提温度为60℃，碱提时间为4h。

19、优选地，所述步骤s3中，酸液为盐酸、硝酸、硫酸中的任一。

20、进一步优选地，所述酸液为盐酸。

21、优选地，所述步骤s3中，酸液调节ph和透析中间，加入碘液反应后不变蓝。

22、加入碘液是为检测前序步骤处理后废渣中的α-葡聚糖含量，未避免影响后续废渣提取率进行的验证步骤。

23、优选地，所述步骤s3中，乙醇为体积浓度80％的乙醇水溶液。

24、此处乙醇的浓度无需过高，以80％的乙醇水溶液就足够用于沉淀多糖。在沉淀过程中，将乙醇水溶液逐渐加入提取液，使浓度逐渐增加，从而促使多糖沉淀。沉淀后，可以通过离心将多糖沉淀物与乙醇溶液分离。

25、优选地，冻融的温度分别为-20℃和4℃。

26、具体地，冻干后的样品加水复溶，于-20℃冷冻12～24h后，5000rpm 4℃离心10min，收集冷水不溶物。

27、本发明的第二个发明目的在于提供了富含β葡聚糖的灰树花碱提多糖，其由上述方法制得。该灰树花碱提多糖的特点在于β葡聚糖含量高。

28、灰树花碱提多糖结构复杂，根据其化学组成，分为α型与β型葡聚糖，其中β-葡聚糖可用于免疫调节、抗肿瘤和抗炎症，而α-葡聚糖可用于皮肤保养和抗衰老。

29、优选地，上述灰树花碱提多糖的含60％以上的β葡聚糖。

30、由高效液相色谱分析得知，制得的灰树花碱提多糖(gfap)的多糖含量较高，为89.29％。gfap中的蛋白质含量均较低，为2.4％。gfap中总葡聚糖的含量为62.34％，其中β-葡聚糖含量为60.57％，α-葡聚糖及有游离d-葡萄糖含量为1.77％。因此，gfap中多糖含量较高，且其中含有丰富的β-葡聚糖。

31、在上述基础上，再通过ft-ir测试可知，灰树花碱提多糖在1000～1100cm-1、1400～1530cm-1、2800～2900cm-1、3100～3500cm-1均有多糖的特征吸收峰。3320.82cm-1处吸收峰是-oh的特征吸收峰，2923.56cm-1和2890.77cm-1处吸收峰是-ch2基团中c-h伸缩振动引起的，1637.27cm-1处吸收峰是-oh弯曲振动吸收峰，1200～1000cm-1处的强吸收峰是c-o-c伸缩振动、糖环振动以及糖环上连接的c-oh侧基和糖苷键的振动叠加而成。而896cm-1处的吸收峰可以判断是β-d-吡喃糖c-h弯曲振动的特征吸收峰，说明gfap是由β-d-吡喃型葡萄糖环，分子存在以β-糖苷键连接组成。同时，制得的灰树花碱提多糖具有代表物质生理活性的三螺旋结构，证明灰树花碱提多糖可刺激人体免疫细胞的膜蛋白受体起到增强免疫的作用。

32、本发明的第三个发明目的在于提供了上述富含β葡聚糖的灰树花碱提多糖在制备减肥药物或减肥保健品或减肥食品上的应用。

33、已知β-葡聚糖可用于免疫调节、抗肿瘤和抗炎症，对于疾病治疗和保健具有较好的功效。因而本技术的发明人针对治疗保健方向进行探索，意外发现所制得的富含β葡聚糖的灰树花碱提多糖在减肥领域有着较好的表现。本发明人以高脂诱导的肥胖小鼠为模型(hfd)，通过分析不同剂量的灰树花碱提多糖对肥胖表观指标、脂代谢相关生化指标的影响，同时通过对肝脏和脂肪形态学的观察，了解灰树花碱提多糖对糖脂代谢作用，发现灰树花碱提多糖具有显著的抑制肥胖作用，及其对肠道菌群有良好的调节作用。

34、更进一步地，富含β葡聚糖的灰树花碱提多糖可通过提高调节血糖能力、调控肝脏脂代谢蛋白表达水平、改善炎症实现在减肥上的应用。

35、因此，本发明具有以下有益效果：

36、(1)本发明提供的制备方法中，利用灰树花子实体水提后的残渣进行碱提，达到充分利用原料的目的，且冻融操作简单，制得的灰树花碱提多糖(gfap)得率高，多糖含量高达89.29％，通过megazyme试剂盒测得其含有丰富的β-葡聚糖(≥60％)。

37、(2)本发明使用碱液提取，相比以前的热水提取乙醇提取节省原料，方法适用于工业化生产，能够有效的综合利用水提渣，同时节约生产成本，且操作简单，提取的灰树花碱提多糖β葡聚糖含量高，天然无毒，具有潜在的提高免疫功能，具有良好的经济效益与社会效益。

38、(3)本发明提出灰树花碱提多糖具有显著的抑制肥胖作用及对肠道菌群有良好的调节作用，并公开了基于肠道菌群研究碱提灰树花碱提多糖改善肥胖的作用机制，为后续的研究和产品开发提供了思路。