水稻抗稻瘟病基因的功能性KASP分子标记及其应用

本发明属于水稻分子标记和育种领域，涉及基于kasp技术用于水稻抗稻瘟病基因pita、pid2、pi25/pid3和ptr的基因分型的引物组合及应用，能够有效地对水稻种质资源及杂交后代进行早期抗病基因型筛选，提高水稻抗病育种的效率。

背景技术：

1、稻瘟病是由稻瘟病菌(magnaporthe grisea)引起的一种极具破坏性的水稻病害，全球每年因稻瘟病害可减产10％～30％。从环境保护与农业可持续发展考虑，利用寄主抗性，选育和种植稻瘟病抗性品种是防治稻瘟病最安全有效的方法。传统抗性品种选育一般依靠表型鉴定，且需要加大群体规模和增加鉴定批次以减少环境和人为因素的影响，这极大地增加了抗性育种的工作量与成本。利用已克隆的稻瘟病抗性基因的连锁标记或功能基因标记，从分子水平跟踪目标基因，选择含有目标抗性基因的单株进行杂交或回交，不仅能精准指导抗病性状的定向改良，并且能减少杂交或回交群体的大小，节省成本。

2、随着dna分子标记的出现与迅猛发展，标记辅助选择(marker-assistedselection,mas)技术已成为正确选择抗病基因的有效途径。但由于抗病基因与分子标记间的重组率在不同的群体中有较大差异，同时构建分子标记的群体往往不是育种材料，在实际应用中有一定的局限性。现有技术中的分子标记大多不是基因本身，在大量群体育种中可能出现不连锁的情形，导致无法选择抗病基因。而少部分针对抗病基因本身设计的标记，常需要多对引物或酶切等实验鉴别抗感病基因型，增加育种工作量。因此，基于抗病基因本身建立相应的分子标记，即将功能标记与目标基因共分离而且直接来自基因位点上决定功能的多态性基序，相对于传统的标记方法，具有在人工群体和自然群体的选择中均有效、群体基因检测更高效的优点。

3、分子标记辅助选择育种(molecular marker-assisted selection，mas)是一种利用分子标记对植物或动物个体进行遗传分析和筛选的育种策略。snp(single nucleotidepolymorphism)即单核苷酸多态性，是两个dna序列中的某个位点由于单个核苷酸的变化而引起的多态性。snp标记的优点在于数量多，分布广，相对稳定，可以在早期(苗期)进行分子标记分析，快速鉴定个体的遗传特征抗病基因的基因型。通过，可以提供有关其遗传特征和表型性状的信息，从而帮助育种者选择具有期望性状的个体进行繁殖和育种。

4、kasp(kompetitive allele-specific pcr)是一种基于pcr的分子标记技术，用于检测基因组中的snp。kasp结合了特异性引物和特异性探针的设计，通过竞争性特性确定目标snp的等位基因。因kasp技术对检测样本纯度及浓度(1-10ng dna即可加入反应)要求不高，且具有高准确度、灵活性及低成本的特性，是一种高效、准确、经济且具有可扩展性的分子标记技术。在遗传研究、种质资源评价、育种和基因组学研究等领域中发挥着重要的作用。例如，cn202111483095.3公开了一种快速鉴定苹果炭疽叶枯病的snp分子标记用于苹果杂交种鉴定的核心snp标记，基于其设计的引物组合，能够快速检测存在苹果中炭疽叶枯病的种质，从而有效对苹果杂种实生苗进行早期抗病筛选，提高苹果抗病育种的效率；cn201710297282.x公开了基于kasp技术用于水稻产量基因分型的引物组合及其应用方法，利用所述水稻产量基因分型引物组合，以及提供的kasp检测方法，能够实现水稻种质中常量基因功能等位基因的情况，结果准确，从而达到快速高效低成本的检测。但现有技术中尚未发现采用kasp技术进行水稻稻瘟病分子标记辅助选择的研究。

技术实现思路

1、针对现有技术的缺陷，本发明提供基于kasp技术用于水稻抗稻瘟病基因pi-ta、pi-d2、pi25/pid3和ptr的功能性分子标记及其应用。采用本发明所述的分子标记及鉴定方法可以对水稻种质资源和育种子代在苗期进行抗病基因型筛选，淘汰携带感病基因型子代植株，大大提高水稻抗病育种效率。

2、本发明提供的技术方案如下：

3、本发明提供基于kasp技术用于水稻抗稻瘟病基因pi-ta、pi-d2、pi25/pid3和ptr的功能性分子标记，包括pi-ta分子标记、pi-d2分子标记、pi25/pid3分子标记和ptr分子标记；

4、所述pi-ta分子标记位于水稻pi-ta基因第2752位核苷酸，该位点为g时，为pi-ta抗病等位基因，该位点为t时，为pi-ta感病等位基因；

5、所述pi-d2分子标记位于水稻pi-d2基因第1323位核苷酸，该位点为a时，为pi-d2抗病等位基因，该位点为t时，为pi-d2感病等位基因；

6、所述pi25/pid3分子标记位于水稻pi25/pid3基因第2209位核苷酸，该位点为c时，为pi25/pid3抗病等位基因，该位点为t时，为pi25/pid3感病等位基因；

7、所述ptr分子标记位于水稻ptr基因第2606位和第2611位的核苷酸变异以及第2608位12个核苷酸的插入/缺失变异，2606位为t、2612位为g且2608位缺失12bp序列时，为ptr抗病等位基因；而2606位为a、2612为a且2608位插入12bp序列时，为ptr感病等位基因；所述12bp序列为aaaccagaaaaa。

8、本发明还提供基于kasp技术用于水稻抗稻瘟病基因pi-ta、pi-d2、pi25/pid3和ptr的显性功能分子标记的引物，所述引物序列如下：

9、pi-ta上游分型引物1：

10、gaaggtgaccaagttcatgctcaagtcaggttgaagatgcatagc

11、pi-ta上游分型引物2：

12、gaaggtcggagtcaacggatttcaagtcaggttgaagatgcataga

13、pi-ta下游通用引物：

14、ctctgccgtggcttctatctttac

15、pi-d2上游分型引物1：

16、gaaggtgaccaagttcatgctcctatgatagccaaagttccgagt

17、pi-d2上游分型引物2：

18、gaaggtcggagtcaacggatttatgatagccaaagttccgagc

19、pi-d2下游通用引物：

20、ggagtgatagtggcagtgggaag

21、pi25/pid3上游分型引物1：

22、gaaggtgaccaagttcatgctgcacttcttgactactgtctgcctg

23、pi25/pid3上游分型引物2：

24、gaaggtcggagtcaacggattagcacttcttgactactgtctgccta

25、pi25/pid3下游通用引物：

26、attcatcttacccgtcttgggatc

27、ptr上游分型引物1：

28、gaaggtgaccaagttcatgcttaaaagttcatcgcatcgaatttaa

29、ptr上游分型引物2：

30、gaaggtcggagtcaacggattgtaaaagttcatcgcatcgaatttat

31、ptr下游通用引物：

32、gtatttcgcaggcataaactcgta。

33、本发明还提供上述水稻抗稻瘟病基因功能性分子标记或引物在抗稻瘟病水稻种质资源的筛选、鉴定或分子标记辅助育种中的应用。

34、进一步的，按照上游分型引物1：上游分型引物2：下游通用引物＝1:1:3的比例形成混合引物，引物终浓度为10μm。

35、进一步的，利用上述引物对水稻基因组dna进行pcr扩增，根据扩增结果判断所含水稻抗稻瘟病基因pi-ta、pi-d2、pi25/pid3和ptr分型结果。

36、进一步的，dna提取方法包括：取生长两周的水稻叶片100mg，置于含有钢珠的2ml离心管中，立即液氮冷冻5min，置于球磨仪中充分破碎植物组织，提取基因组dna；dna样品的浓度及纯度用核酸蛋白检测仪进行检测，调整dna浓度为50ng/μl，于-20℃保存备用。

37、进一步的，pcr反应体系为5μl，包括2.5μl 2×kasp master mix、dna模板1.25μl、混合引物1.25μl，并在每个96孔板上设置无模板对照。

38、进一步的，反应条件为：(1)95℃预变性10min；(2)95℃变性20s、55-61℃退火/延伸60s，共10个循环；(3)95℃变性20s、55℃退火/延伸60s，共27个循环。

39、进一步的，pcr反应结束后，利用bio-rad cfx荧光定量pcr仪对kasp反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描结果导出列表格式，制作分型图。

40、本发明还提供上述引物的试剂或试剂盒。

41、有益效果

42、根据水稻抗稻瘟病基因pi-ta、pi-d2、pi25/pid3和ptr的序列变异决定抗感性的特征，本发明公开了新的pi-ta、pi-d2、pi25/pid3和ptr基因显性功能分子标记及其应用。还公开了所述稻瘟病抗性基因pi-ta、pi-d2、pi25/pid3和ptr显性功能分子标记的检测方法及其应用，对不同遗传背景水稻品种的基因组dna进行pcr扩增和分型图制作，可在携带pi-ta、pi-d2、pi25/pid3和ptr抗病和感病等位基因的水稻样品中得到的不同的分型结果。本发明建立基于kasp技术用于水稻抗稻瘟病基因pi-ta、pi-d2、pi25/pid3和ptr的显性功能分子标记及其应用，并对长江中下游粳稻稻区主栽水稻品种进行鉴定，为水稻抗病品种的分子标记辅助育种和品种改良提供依据。

43、本发明所提供的基于kasp技术用于水稻抗稻瘟病基因pi-ta、pi-d2、pi25/pid3和ptr的显性功能分子标记及其应用，通过使用kasp技术可以简单快速的检测snp位点的分型情况，进而鉴定水稻抗稻瘟病基因pi-ta、pi-d2、pi25/pid3和ptr等位基因情况，相较现有的相关紧密连锁标记和功能型分子标记，具有特异性强、不需要酶切反应、鉴定步骤简单、仅利用常规仪器等优势，仅通过一轮pcr反应和电泳检测，可直接用于稻瘟病抗性基因pi-ta、pi-d2、pi25/pid3和ptr等位基因的鉴别，有效降低鉴定成本，提高标记利用效率。

44、本发明所提供的基于kasp技术用于水稻抗稻瘟病基因pi-ta、pi-d2、pi25/pid3和ptr的显性功能分子标记及其应用，填补了该基因尚无功能性分子标记的空白，为基因pi-ta、pi-d2、pi25/pid3和ptr等位基因在抗病育种中的广泛应用提供了技术支持。

45、本研究利用新开发的基因pi-ta、pi-d2、pi25/pid3和ptr等位基因显性功能分子标记，对10组江苏省近年来主栽水稻品种的杂交后代共505份进行鉴定，结果表明pi-ta、pi-d2、pi25/pid3和ptr抗病等位基因在供试品种中存在频率较高，可有效预防多种稻瘟病菌的侵染，应继续加强基因监测，以防丢失。