连接蛋白43的单克隆抗体及应用

本发明涉及生物，尤其涉及cx43的单克隆抗体以及该抗体的应用。

背景技术：

1、间隙连接（gap junction）是普遍存在于相邻细胞间的一种膜蛋白通道结构，由间隙连接蛋白（connexin cx）构成。cx43是一种主要的间隙连接蛋白，首先在心肌组织中被发现，后陆续在卵巢、晶状体、平滑肌、成纤维细胞、骨细胞中发现，因分子量为43 kda故命名为cx43。cx43是分布最多且最广泛的一种间隙连接蛋白，它在内质网核糖体上合成之后，转运至高尔基体内形成由6个连接蛋白组成的半通道，即连接子，之后通过运输小泡被运输到质膜上，cx43在质膜上存在4个跨膜区域，其中n端和c端位于细胞膜胞质侧。生长因子、肿瘤促进因子、癌基因蛋白激酶、激素和炎症介质等均可通过磷酸化羧基端的丝氨酸和/或酪氨酸来调控间隙连接通道功能。间隙连接区域对于各组织器官建立合适的细胞间交流水平起到非常重要的作用，这依赖于间隙连接能够快速地重塑、周转，始终处于高度动态中。

2、cx43调节各种器官包括骨骼、大脑、骨髓和心脏的发育过程，也在心肌细胞和平滑肌增殖分化、神经元信号传导中发挥重要作用，还参与内分泌腺和外分泌腺的激素分泌和功能、听觉功能、伤口愈合 、精子发生、类固醇生成、卵泡发育、排卵和黄体形成等生殖功能，以及组织炎症和组织修复等免疫调节功能。此外，cx43的表达与癌症复发、转移扩散及不良预后相关。同时，cx43还具有膜通道功能非相关的细胞增殖调节能力。

3、虽然cx43发挥重要的作用，但其基因的表达调控，磷酸化修饰反应调控以及泛素化与降解等具体机制还有诸多的谜题，需要进一步的挖掘解答。本发明提供的单克隆抗体可以特异性识别连接蛋白cx43，与其他连接蛋白无交叉反应，具有高亲和力、高灵敏度、高特异性的优点，并提供一种准确检测组织中cx43蛋白含量的方法，对于cx43的进一步深入研究有着重大的意义。

技术实现思路

1、本发明提供了一种抗cx43蛋白的抗体，所述抗体是以连接蛋白43（cx43）的不同结合位点多肽(seq id no 7-9)偶联到载体蛋白上作为免疫原，免疫小鼠制备杂交瘤细胞获得。在具体的实施方式中，所述载体蛋白为klh，所述抗体能够特异性识别cx43蛋白。

2、一方面，本发明提供了抗cx43蛋白的抗体，所述抗体具有轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.1-3任一所示，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no.4-6任一所示。

3、在一个实施方式中，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no.4所示。

4、在一个实施方式中，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no.5所示。

5、在一个实施方式中，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no.6所示。

6、在一个实施方式中，所述抗体是重组抗体、单克隆抗体或多克隆抗体，优选，单克隆抗体。

7、在一个实施方式中，所述抗体是鼠源抗体、人源抗体或嵌合抗体。

8、在优选的实施方式中，所述抗体是小鼠抗体。

9、在一个实施方式中，所述抗体还包括包含选自igg1、igg2、igg3或igg4的igg的重链恒定区。

10、在一个实施方式中，所述抗体的恒定区选自igg1或igg2a。

11、在一个实施方式中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no.4所示，所述抗体的恒定区选自igg1。

12、在一个实施方式中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no.5所示，所述抗体的恒定区选自igg1。

13、在一个实施方式中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no.6所示，所述抗体的恒定区选自igg2a。

14、另一方面，本发明还提供了产生上述抗体的杂交瘤细胞。

15、另一方面，本发明还提供了上述抗体在检测cx43蛋白中的应用。

16、另一方面，本发明提供了一种检测cx43蛋白的方法，所述方法包括利用上述抗体对cx43蛋白进行检测的步骤。

17、在一个实施方式中，所述方法为间接免疫酶联吸附（elisa）法、蛋白质印迹法（westernblot，wb）、免疫组织化学（immunohistochemistry, ihc）法或免疫荧光法（immunofluorescence，if）。

18、另一方面，本发明还提供了一种双抗体夹心法定量检测cx43蛋白的方法，所述方法包括利用上述抗体对cx43蛋白进行检测的步骤。

19、在一个实施方式中，所述双抗体夹心法中采用第一抗体和第二抗体，所述第一抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述第一抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no.5所示；所述第二抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述第二抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no.6所示。

20、另一方面，本发明还提供了一种用于检测cx43蛋白的试剂，所述试剂包括上述抗体。

21、另一方面，本发明还提供了一种检测样品中cx43蛋白的方法，所述方法包括利用上述抗体对cx43蛋白进行检测的步骤。

22、在一个实施方式中，所述样品选自人体或其他动物的组织细胞裂解液。

23、另一方面，本发明还提供了一种抗原多肽，所述抗原多肽的氨基酸序列如seq idno.7-9任一所示。

24、另一方面，本发明还提供了结合上述抗原多肽的抗体。

25、在优选的实施方式中，所述抗体具有轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.1-3任一所示，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no.4-6任一所示。

26、在一个实施方式中，所述抗原多肽的氨基酸序列如seq id no.7所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seqid no.4所示。

27、在一个实施方式中，所述抗原多肽的氨基酸序列如seq id no.8所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seqid no.5所示。

28、在一个实施方式中，所述抗原多肽的氨基酸序列如seq id no.9所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seqid no.6所示。

29、本发明使用可以诱发机体产生免疫反应连接蛋白43（cx43）的不同结合位点多肽(seq id no.7-9)偶联至klh作为免疫原免疫小鼠，采用杂交瘤技术经过细胞融合并筛选得到能持续、稳定分泌抗cx43蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，由该细胞株分泌得到单克隆抗体。由三条连接蛋白43（cx43）的不同结合位点多肽与载体蛋白偶联作为免疫原制备获得的单克隆抗体能够特异性地识别cx43，分别为多肽1组23个阳性克隆，多肽2组15个阳性克隆，多肽3组39个阳性克隆。复筛筛选出多肽1组2个阳性克隆，多肽2组2个阳性克隆，多肽3组5个阳性克隆，进一步筛选出多肽1组1个克隆，多肽2组1个阳性克隆，多肽3组1个阳性克隆，分别将这几株单克隆抗体分别称之为clone 1-1e2、clone 2-1g11和clone 3-2g12。这几株单克隆抗体具有良好的亲和力，实验表明这几株单克隆抗体与cx43蛋白结合实验，抗体滴度可达到0.001 μg/ml以上，且与其他相关蛋白无明显特异性交叉；且可应用蛋白免疫印迹、免疫荧光、免疫组织化学方法检测体内cx43蛋白表达及分布。此外，由于clone 2-1g11和clone 3-2g12识别cx43蛋白的不同的抗原位点，因此可以采用双抗夹心法，分别利用特异识别的两个单克隆抗体对cx43蛋白进行检测。从而，本发明提供一种用于cx43蛋白检测的方法，可以准确检测样品中cx43蛋白的含量。