抗BCMA单域抗体及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物医药领域，具体涉及抗bcma单域抗体及其制备方法与应用。

背景技术：

1、多发性骨髓瘤(mm)是一种单克隆浆细胞异常增殖的恶性疾病，是血液系统常见恶性肿瘤。mm常见的症状包括骨髓瘤相关器官功能损伤以及继发淀粉样变性等相关表现。中国多发性骨髓瘤诊治指南(2022年修订)推荐经全身体能状态评分良好的多发性骨髓瘤患者，首选自体造血干细胞移植(autologous hematopoietic stem cell transplantation，asct)，对于年轻的具有高危预后因素且有合适供者的患者，可考虑异基因造血干细胞移植(allo-sct)。另外，复发患者也可采用嵌合抗原受体t细胞(car-t)(临床试验、研究者发起的研究)治疗方案。目前以bcma(b-cell maturation antigen)为靶点的car-t疗法已证明在多发性骨髓瘤中具有临床有效性。bcma(cd269，tnfrsf17)是一种iii型跨膜糖蛋白，属于人类肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族，在b细胞成熟和分化为浆细胞中起主要作用。baff和april是与bcma结合的两种b细胞激活和扩增诱导配体，共同调控b细胞功能。bcma主要在成熟的b细胞中表达，其表达量随着b细胞的发育成熟而逐渐增加，并且在浆细胞恶性转化过程中选择性地过度表达，促进肿瘤细胞生长、存活和耐药性的发生。bcma在多种肿瘤细胞上高表达，而在其他正常组织不表达或者表达量低，是癌症靶向治疗的理想靶点。

2、重链抗体(heavy chain antibody，hcab)是天然存在的一种抗体类型，是骆驼科动物或软骨鱼类所具有的独特抗体类型，其抗体结构域天然缺失轻链，只由两条重链组成。重链抗体的抗原识别功能主要由重链抗体的可变区(vhh)决定。单独的vhh即可以识别抗原，因此其又被称为单域抗体(single-domain antibody，sdab)。单域抗体缺失抗体轻链，只有重链可变区，因其分子量小，也被称为纳米抗体(nanobody，nb)。单域抗体的分子量只有约13-15kda，直径约为2.5nm，长4nm，是迄今为止最小的具有抗原结合功能的抗体片段，其与抗原结合的能力及其稳定性同完全抗体基本一致或具有更高的特异性抗原亲和力。与传统抗体相比，单域抗体还具有许多独特的性质，比如更好的组织渗透性、更高的热稳定性和化学稳定性、可抵达特殊抗原表位、可砌块模式任意组合、生产成本低等。获得单域抗体的常规方法由多次免疫骆驼科动物、b淋巴细胞分离、vhh区扩增、展示文库构建和筛选等众多步骤构成。随着合成生物学的发展，构建基于全合成的高质量随机化大容量单域抗体库成为可能。目前，vhh单域抗体因其结构稳定、分子小、溶解性好、组织渗透性好、易于重组表达、与人源抗体同源性高易于人源化和免疫原性低等优点，已经被广泛使用在小型化基因工程抗体研究、新药开发以及疾病的诊断治疗上。单域抗体在生物医学研究和医学治疗方面具有广泛的应用前景。

技术实现思路

1、本发明的目的之一是提供一种靶向bcma抗原的单域抗体及其在肿瘤靶向治疗中的应用。

2、为实现上述目的，本发明首先提供了单域抗体，名称为bcma-vhh-54，所述单域抗体可由重链可变区(vhh)组成，所述重链可变区可包含氨基酸序列分别是seq id no.1的第26-33位的互补决定区cdr1、seq id no.1的第51-58位的互补决定区cdr2和seq id no.1的第97-106位的互补决定区cdr3。

3、所述单域抗体(抗bcma单域抗体)可为特异性结合bcma蛋白的单域抗体。

4、进一步地，所述重链可变区的氨基酸序列可为seq id no.1或与seq id no.1具有至少80％的同一性且具有相同的功能的氨基酸序列。

5、所述单域抗体bcma-vhh-54只有重链抗体的可变区(vhh)，依次由框架区fr1、互补决定区cdr1、框架区fr2、互补决定区cdr2、框架区fr3、互补决定区cdr3和框架区fr4组成。

6、所述单域抗体bcma-vhh-54的氨基酸序列可为seq id no.1。其中，seq idno.1的第1-25位为框架区fr1，第26-33位为互补决定区cdr1，第34-50位为框架区fr2，第51-58位为互补决定区cdr2，第59-96位为框架区fr3，第97-106位为互补决定区cdr3，第107-117位为框架区fr4。编码单域抗体bcma-vhh-54的核酸分子(bcma-vhh-54基因)的核苷酸序列如seq id no.2所示。

7、所述互补决定区的序列根据kabat编号系统定义。

8、本发明单域抗体序列具有改善的亲和力和/或效价的其他变体可通过采用在本领域已知的方法来获得，并包括在本发明的保护范围内。例如，氨基酸置换可用于获得具有进一步改善的亲合力的抗体。或者，核苷酸序列的密码子优化也可用来改善用于产生抗体的表达系统中的翻译效率。此外，包含通过对本发明的任何核酸序列应用定向进化法而优化抗体特异性的序列的多核苷酸也属于本发明的范围内。

9、在某些实施方案中，可以在本发明所述单域抗体的一个或多个互补决定区或框架区内发生替代、插入或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对互补决定区和/或框架区做出保守变化(例如，保守替代，本领域技术人员所熟知，氨基酸的保守性取代不改变蛋白质的性质和功能)，其不实质性降低结合亲和力。例如，此类变化可以在互补决定区中的抗原接触残基以外。

10、本发明还提供了与所述单域抗体bcma-vhh-54相关的生物材料，所述生物材料可为下述任一种：

11、c1)编码所述单域抗体bcma-vhh-54重链可变区的核酸分子；

12、c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；

13、c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；

14、c4)含有c1)所述核酸分子的重组宿主细胞、或含有c2)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有c3)所述重组载体的重组宿主细胞。

15、其中，c4)所述的重组宿主细胞可表达所述单域抗体bcma-vhh-54。

16、上述生物材料中，所述核酸分子可为下述任一种：

17、d1)核苷酸序列或编码序列是seq id no.2的dna分子；

18、d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的dna分子。

19、seq id no.2所示的dna分子编码氨基酸序列为seq id no.1的单域抗体bcma-vhh-54。

20、上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

21、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

22、本文所述宿主细胞(也称为受体细胞)是指可用于导入载体的任何类型的细胞。宿主细胞可以是真核细胞(例如hek293、cho和骨髓瘤细胞等)，或者可以是原核细胞(例如大肠杆菌等)。所述宿主细胞可理解为不仅是指特定的受体细胞，而且也指这种细胞的后代，且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致，但仍包括在宿主细胞的范围中。在本发明的一个或多个实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌tg1和/或hek293细胞。

23、本文所述重组载体是指将外源目的基因与载体在体外连接构建而成的重组dna分子，可以任何合适的方式构建，只要构建的重组载体可携带外源目的基因进入受体细胞、并为外源目的基因提供在受体细胞的复制、整合、扩增和/或表达能力即可。在本发明的一个或多个实施方案中，所述重组载体为pcdna3.1-bcma-vhh-54-hfc。

24、所述重组载体pcdna3.1-bcma-vhh-54-hfc是为了便于纯化，在单域抗体bc ma-vhh-54的编码基因(seq id no.2)3'末端添加人源igg1fc基因(hfc基因，核苷酸序列为seqid no.3)，得到bcma-vhh-54-hfc融合基因，然后分别在该融合基因的5’端起始密码子前加入bamhi酶切位点，3’端终止密码子后加入ecori酶切位点，将其克隆至真核表达载体pcdna3.1的bamhi和ecori识别位点之间，得到表达c端融合hfc基因的单域抗体bcma-vhh-54的重组真核表达载体pcdna3.1-bc ma-vhh-54-hfc。所述重组真核表达载体pcdna3.1-bcma-vhh-54-hfc含有seq id no.2所示的单域抗体bcma-vhh-54的编码基因。

25、人源igg1fc基因核苷酸序列(696bp)如seq id no.3所示，其编码的氨基酸序列如seq id no.4所示。

26、本发明还提供了所述单域抗体bcma-vhh-54和/或所述生物材料的下述任一种应用：

27、e1)在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的应用，或在预防或治疗肿瘤中的应用；

28、e2)在制备用于预防或治疗bcma靶点相关疾病的药物中的应用，或在预防或治疗bcma靶点相关疾病中的应用；

29、e3)在制备用于筛查、诊断或辅助诊断bcma靶点相关疾病的产品中的应用，或在筛查、诊断或辅助诊断bcma靶点相关疾病中的应用；

30、e4)在检测bcma蛋白或制备用于检测bcma蛋白的产品中的应用；

31、e5)在制备用于结合bcma蛋白的产品中的应用；

32、e6)在介导药物特异性地识别表达bcma抗原的肿瘤或制备介导药物特异性地识别表达bcma抗原的肿瘤的产品中的应用；

33、e7)在bcma蛋白的体内显像或制备用于bcma蛋白的体内显像的产品中的应用；

34、e8)在制备靶向bcma的car细胞中的应用。

35、本文中，所述bcma靶点相关疾病可为bcma阳性癌症(如多发性骨髓瘤)。

36、本文中，所述bcma阳性癌症可包括多发性骨髓瘤(multiple myeloma，mm)、慢性髓细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，cml)、b细胞急性淋巴细胞白血病(acute b-lymphoblastic leukemia，all)、非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin lymphoma，nhl)和霍奇金淋巴瘤(hodgkin lymphoma)但不限于此。

37、e6)中所述介导药物特异性地识别表达bcma抗原的肿瘤的产品可为特异性靶向bcma蛋白的载药系统，所述载药系统含有所述单域抗体bcma-vhh-54。

38、所述载药系统可为脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统、聚合物圆盘递药系统或纳米粒递药系统。

39、所述载药系统可用于药物的靶向运输和/或定点释放。

40、本发明还提供了试剂盒，所述试剂盒含有所述单域抗体bcma-vhh-54，所述试剂盒可具有下述任一用途：

41、f1)检测bcma蛋白；

42、f2)筛查、诊断或辅助诊断bcma靶点相关疾病；

43、f3)用于bcma蛋白的体内显像。

44、所述试剂盒可为化学发光免疫试剂盒、酶联免疫检测试剂盒、胶体金免疫试剂盒、或荧光免疫试剂盒，但不限于此。

45、本文所述检测bcma蛋白可为检测待测样品中是否含有bcma蛋白和/或检测待测样品中bcma蛋白的含量。

46、所述待测样品可为细胞或组织样品。

47、本文所述用于检测bcma蛋白的产品包括利用酶联免疫吸附法、免疫荧光检测法、放射免疫法、发光免疫测定法、胶体金免疫层析法、凝集法或免疫比浊法等检测抗原抗体结合的产品。

48、本文所述产品可为试剂、试剂盒、芯片或试纸。

49、本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物可含有所述单域抗体bcma-vhh-54。

50、进一步地，所述药物组合物还可含有药学上可接受的载体。

51、所述药学上可接受的载体可为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。

52、所述药物组合物可具有下述至少一种用途：

53、m1)用于预防或治疗肿瘤；

54、m2)用于预防或治疗bcma靶点相关疾病；

55、m3)用于介导药物特异性地识别表达bcma抗原的肿瘤。

56、本发明还提供了所述单域抗体bcma-vhh-54的制备方法，所述方法可包括：构建含有本文所述核酸分子(编码所述单域抗体bcma-vhh-54重链可变区的核酸分子)的重组表达载体；将所述重组表达载体导入宿主细胞，获得表达所述单域抗体的重组细胞；培养所述重组细胞，经分离纯化获得所述单域抗体。

57、进一步地，所述编码所述单域抗体bcma-vhh-54重链可变区的核酸分子可为下述任一种：

58、d1)核苷酸序列或编码序列是seq id no.2的dna分子；

59、d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的dna分子。

60、进一步地，所述宿主细胞可为hek293细胞。

61、进一步地，所述导入可为通过磷酸钙共沉淀法、脂质体介导法、电穿孔法或病毒载体法等任何已知的转染方法将携带本发明单域抗体基因的载体转化宿主细胞。

62、本发明还提供了诊断或辅助诊断bcma靶点相关疾病的方法，所述方法可包括：从受试者分离获得样品，然后利用所述单域抗体bcma-vhh-54检测所述样品中bcma蛋白的含量，根据所述bcma蛋白的含量进行bcma靶点相关疾病的诊断或辅助诊断。

63、本发明还提供了筛查bcma靶点相关疾病的方法，所述方法可包括：从受试者分离获得样品，然后利用所述单域抗体bcma-vhh-54检测所述样品中bcma蛋白的含量，根据所述bcma蛋白的含量(与疾病筛查标准的bcma蛋白的含量比较)进行bcma靶点相关疾病的筛查。

64、本发明还提供了预防或治疗bcma靶点相关疾病的方法，所述方法可包括向患有bcma靶点相关疾病的受试者施用所述单域抗体bcma-vhh-54或本文所述药物组合物。

65、上述方法中，所述bcma靶点相关疾病可为bcma靶点相关肿瘤。

66、上述方法中，所述bcma靶点相关肿瘤可为bcma阳性癌症。

67、上述方法中，所述bcma阳性癌症可包括多发性骨髓瘤、慢性髓细胞白血病、b细胞急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤但不限于此。

68、本发明还提供了体外检测bcma蛋白的方法，所述方法可包括利用所述单域抗体bcma-vhh-54或本文所述试剂盒检测bcma蛋白。

69、本发明还提供了抗体药物偶联物，包括抗体部分和偶联部分，所述抗体部分可包含所述单域抗体bcma-vhh-54。

70、进一步地，所述偶联部分可包括可检测的标记、化学药物或细胞毒素。

71、所述抗体部分和偶联部分可直接或通过接头共价连接。

72、所述可检测的标记可选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。

73、所述化学药物可为可杀伤肿瘤细胞的药物。

74、所述细胞毒素可为微管蛋白抑制剂(如美登素、阿里他汀)、dna合成抑制剂(如卡奇霉素)或rna合成抑制剂(如鹅膏毒素)。

75、本发明所述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。

76、本文所述bcma(cd269，tnfrsf17)是一种iii型跨膜糖蛋白，属于人类肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族，在b细胞成熟和分化为浆细胞中起主要作用。baff和april是与bcma结合的两种b细胞激活和扩增诱导配体，共同调控b细胞功能。bcma主要在成熟的b细胞中表达，其表达量随着b细胞的发育成熟而逐渐增加，并且在浆细胞恶性转化过程中选择性地过度表达，促进肿瘤细胞生长、存活和耐药性的发生。bcma在多发性骨髓瘤、b细胞急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、和霍奇金淋巴瘤等肿瘤细胞上表达。

77、本发明首先利用bcma重组蛋白免疫羊驼得到单域抗体基因，并构建单域抗体表达文库，然后通过噬菌体展示筛选技术从单域抗体表达文库中筛选得到高亲和力的抗bcma单域抗体(bcma-vhh-54)。测序得到抗体基因序列后，采用基因工程的方法制备bcma-vhh-54。进一步对获得的抗体进行了亲和力、特异性等功能实验。结果表明，本发明的单域抗体亲和力高，能够很好地特异性靶向bcma阳性细胞(表达bcma蛋白的细胞)，并可以成功应用于mm患者骨髓细胞中bcma的表达的检测。本发明的单域抗体可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组系统中表达和生产，可制成临床上用于预防和治疗bcma靶点相关疾病(多发性骨髓瘤、b细胞急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤)的特异性抗体药物，或bcma蛋白的检测试剂盒等。本发明单域抗体药物结构稳定、分子小、易于重组表达、生产成本低，可单独使用或作为载药系统携带相关药物，在药物应用和临床诊断等领域具有十分广阔的前景和重要的意义。