用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的特异性分子靶标及其快速检测方法

本发明属于基因检测领域，具体涉及用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的特异性分子靶标及其快速检测方法。

背景技术：

1、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa，pa)是一种普遍存在的非发酵革兰氏阴性细菌，也是一种条件性病原体，可感染患有各种疾病的患者，包括癌症、艾滋病、严重烧伤创面、手术后创面和囊性纤维化，我国疾控中心已将其列为水源性重要致病菌。铜绿假单胞菌不同血清群的菌株已经被广泛的表征，不同血清群的铜绿假单胞菌与菌株毒力、致病性、临床致死率和成膜能力以及耐药都相关，对铜绿假单胞菌的血清分型诊断有对流行病学观察和临床用药等方面具有重要意义。

2、日本生研所生产的分型血清试剂盒在铜绿假单胞菌感染的流行病学调查现在比较常用。该血清分型有3个群即多价血清i群、ⅱ群和ⅲ群，再细分为a～n 14种单价血清群，主要用于铜绿假单胞菌的流行病学调查。多价血清i群(包括单价血清a、c、h、i、l群)主要分布于食品和自然环境中，其中a群是鲜奶中常见的血清菌株，多价血清ⅱ群(包括单价b、j、k、m群)主要分布于临床菌株中，冯永军等人发现100个医院样本分离株中b群菌株占据了50％，多价血清ⅲ群(包含单价d、e、f、g、n)是最为常见的血清群，主要来源于主要来自动物出血性肺炎和动物食品。在水貂出血性肺炎病原pa的血清群种类中流行血清群最多的为g群。

3、铜绿假单胞菌耐药、毒力、流行病学暴发与血清群直接相关，其中g(o抗原6型)、e(o抗原11型)血清群是引起人类医院流行病学暴发的主要血清群，e群也是高毒力血清群之一。血清玻片凝集法是铜绿假单胞菌血清分型的“金标准”，但存在不足之处，如诊断血清质量要求高，成本昂贵，且如果血清凝集反应迟缓或特异性差，容易对结果误判。以pcr为主的分子生物学检测方法以其快速、准确、简便的特点，逐渐成为取代传统血清分型方法最具潜力的检测技术之一。目前，针对铜绿假单胞菌血清群检测的快速检测方法研究也有报导，但是数量不多。基于开放阅读框铜绿假单胞菌i群特异性基因lmg 14071；e群特异性基因lmg14079；g群特异性基因cip 59.39；b群特异性基因lmg 14072、lmg 14075、lmg 14083；o抗原乙酰基特异性基因。上述基于现有的特异性基因是对开放阅读框的比对筛选之后获得，而针对全基因组数据建立的血清群pcr和qpcr检测靶标及引物的研究报道几乎没有。经对现有技术的文献检索，尚未发现与本发明的7个单铜绿假单胞菌常见血清群特异性新分子靶标及相应的pcr和qpcr检测方法报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的特异性分子靶标及其快速检测方法。本发明的检测方法具有检测时间短、检测成本低、操作简单、特异性强的优点，无需铜绿假单胞菌诊断血清即可检测出目标血清群铜绿假单胞菌菌株，更加具有实用性。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一组用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的特异性分子靶标，所述特异性新分子靶标的核苷酸序列如seq id no:1～seq id no:7任一项所示。

3、泛基因组采用原核生物泛基因组自动化分析软件(pan-genomics analysispipeline，pgap)中的mp方法来分析，通过本地perl脚本对分析结果进行处理，得到所有菌株的核心基因及非核心基因信息。提取目标血清群铜绿假单胞菌菌株特有的非核心基因蛋白序列，通过本地blast分别将其比对铜绿假单胞菌的蛋白总库及ncbi非冗余蛋白数据库(nr)。去除能比对到已知的目标血清群铜绿假单胞菌蛋白的序列，剩下的则为目标血清群铜绿假单胞菌菌株新获得的特有基因。本技术发明人通过大量的筛选和设计验证，最终得到上述特异性分子靶标。本发明的特异性分子靶标对铜绿假单胞菌对应血清群覆盖率为100％且具有很好的特异性，在铜绿假单胞菌其他血清群和非铜绿假单胞菌菌株中不存。

4、本发明还提供用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的引物组，所述引物组用于检测seqid no.1～seq id no.7任一项所述特异性分子靶标；其中，用于检测seq id no.1所述分子靶标的引物组的序列如seq id no.8和seq id no.9所示；用于检测seq id no.2所述分子靶标的引物组的序列如seq id no.10和seq id no.11所示；用于检测seq id no.3所述分子靶标的引物组的序列如seq id no.12和seq id no.13所示；用于检测seq id no.4所述分子靶标的引物组的序列如seq id no.14和seq id no.15所示；用于检测seq id no.5所述分子靶标的引物组的序列如seq id no.16和seq id no.17所示；用于检测seq id no.6所述分子靶标的引物组的序列如seq id no.18和seq id no.19所示；用于检测seq idno.7所述分子靶标的引物组的序列如seq id no.20和seq id no.21所示。

5、本发明还提供用于鉴定铜绿假单胞菌血清群的引物组，所述引物组用于检测seqid no.2、seq id no.3、seq id no.5、seq id no.7任一项所述特异性分子靶标；其中，用于检测seq id no.2所述分子靶标的引物组的序列如seq id no.22和seq id no.23所示；用于检测seq id no.3所述分子靶标的引物组的序列如seq id no.24和seq id no.25所示；用于检测seq id no.5所述分子靶标的引物组的序列如seq id no.26和seq id no.27所示；用于检测seq id no.7所述分子靶标的引物组的序列如seq id no.28和seq id no.29所示。

6、本发明根据所筛选设计得到的用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的特异性分子靶标设计了一系列的引物组，经过大量的筛选和验证发现，最终得到的引物组用于铜绿假单胞菌血清群鉴别时具有很好的特异性，其对铜绿假单胞菌覆盖率为100％，克服了现有铜绿假单胞菌血清群鉴定靶标存在的在非铜绿假单胞菌菌株也能检出的缺点。

7、本发明还提供一种用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的方法，包括以下步骤：

8、(1)使用上述任一项所述引物组中的至少一组对待测样品dna进行pcr扩增；

9、(2)采用进行凝胶电泳检测扩增产物；

10、(3)分析判断扩增产物是否含目标菌。

11、本发明的用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的方法通过对7个铜绿假单胞菌常见血清群特异性分子靶标的保守序列设计扩增引物，并通过对样品进行扩增，采用凝胶电泳检测扩增产物，如电泳结果出现相应的单一扩增条带，则判断样品中含有对应的目标血清群铜绿假单胞菌，如没有出现相应的单一条带，则判断样品中不含目标菌。

12、作为本发明所述的用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的方法的优选实施方式，所述步骤(1)中的pcr扩增的反应体系包括：10×pcr反应缓冲液2.5μl、25mmol/l的mgcl2 2.0μl、2.5mmol/l的dntp 1.0μl、5μmol/l引物对1.0μl、tag酶1u、dna模板1-2μl、灭菌双蒸水补足体积至25μl；所述pcr反应条件为：98℃预变性3min；95℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸60s，共进行35个循环；72℃延伸10min。

13、本发明还提供一种用于定量检测铜绿假单胞菌主要血清群的方法，所述方法采用述引物组中的至少一组对待测样品dna进行qpcr扩增并分析扩增结果。

14、本发明的用于定量检测铜绿假单胞菌主要血清群的方法采用qpcr检测方法，根据铜绿假单胞菌常见血清群特异性分子靶标保守序列seq id no.2设计多价血清ii群的引物、根据seq id no.3设计多价血清iii群的引物、根据seq id no.5设计单价血清e群的引物、根据seq id no.7设计单价血清g群的引物，并通过荧光定量扩增仪进行扩增。在空白对照不存在荧光信号前提下，如果扩增结果产生荧光信号，说明样品中含有目标血清群铜绿假单胞菌；如果不产生荧光信号，则样品中不含有目标血清群铜绿假单胞菌。

15、作为本发明所述的用于定量检测铜绿假单胞菌血清群的方法的优选实施方式，所述qpcr扩增的扩增体系包括2×tb greenpremix反应液10μl，模板dna100ng，10μmol/l引物各1μl，灭菌双蒸水补足体积至20μl；所述qpcr扩增的扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，变性、退火共进行45个循环。

16、本发明还提供上述的用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的特异性分子靶标或所述的引物组在鉴别铜绿假单胞菌血清群中的应用。

17、本发明还提供上述的用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的特异性分子靶标或所述的引物组在定量检测铜绿假单胞菌血清群中的应用。

18、本发明还提供一种用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组。

19、本发明的有益效果：(1)本发明首次使用泛基因组方法学获得铜绿假单胞菌主要血清群靶标，所述的基于铜绿假单胞菌血清群的特异性靶标建立的方法能够快速准确的鉴定铜绿假单胞菌主要血清群，包括多价血清ii群、iii群和单价血清e群和g群；(2)本发明的用于鉴别铜绿假单胞菌血清群特异性新分子靶标及其对应的pcr和qpcr引物对铜绿假单胞菌对应血清群覆盖率为100％；(3)本发明的用于定量检测铜绿假单胞菌血清群的方法线性理想，对纯菌的检出限最低可为101cfu/ml，本发明建立的检测方法灵敏度好，与现有文献报导方法相当或者能优于1～3个数量级，且本发明建立的方法抗干扰能力强，在大肠菌群浓度达到108cfu/ml时，对铜绿假单胞菌血清群的检测也不形成干扰；(4)本发明的方法整个检测过程大约需要15小时左右，而传统方法大约需要3～5天才能完成，本发明所述的检测方法大大节省了检测时间，提高了检测时效。