gRNA及其生物合成方法与流程

文档序号:36248395发布日期:2023-12-02 15:17阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种grna的生物合成方法,其特征在于,所述生物合成方法包括:

2.根据权利要求1所述的生物合成方法,其特征在于,所述rna连接酶包括:

3.根据权利要求1所述的生物合成方法,其特征在于,所述底物包括2个或更多个。

4.根据权利要求1所述的生物合成方法,其特征在于,所述grna的长度为67-146 nt。

5.根据权利要求1所述的生物合成方法,其特征在于,所述grna的序列包括 seq idno:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:41、seq id no:42或seqid no:43中任一项所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的生物合成方法,其特征在于,所述底物包括

7.根据权利要求3所述的生物合成方法,其特征在于,当所述底物为2个时,所述生物合成方法包括:

8.根据权利要求7所述的生物合成方法,其特征在于,所述第二底物的5'端为5'保护基,所述第一底物的3'端为3'保护基。

9.根据权利要求3所述的生物合成方法,其特征在于,当所述底物为3个时,所述底物包括第一底物、第二底物和第三底物,所述生物合成方法包括:

10.根据权利要求9所述的生物合成方法,其特征在于,重复利用所述生物合成方法,将4个或更多个所述底物进行多次连接和所述5'磷酸化,每次连接的所述底物的数量为2个,依次连接获得所述grna。

11.根据权利要求1所述的生物合成方法,其特征在于,利用模板核酸链指导所述底物的连接;

12.根据权利要求11所述的生物合成方法,其特征在于,所述模板核酸链的序列包括seq id no:37、seq id no:39、seq id no:40或seq id no:51所示的核苷酸序列中任一条。

13.根据权利要求11所述的生物合成方法,其特征在于,所述模板核酸链与不同所述底物混合后,恒温孵育或95℃孵育后冷却退火,获得所述含有缺刻的双链核苷酸结构;

14.根据权利要求11所述的生物合成方法,其特征在于,位于所述grna的3'端的底物的3'端为3'保护基,位于所述grna的5'端的底物的5'端为5'保护基。

15.根据权利要求1所述的生物合成方法,其特征在于,所述grna的二级结构通过底物自身或底物之间的自发发生的碱基互补配对形成。

16.根据权利要求9或14所述的生物合成方法,其特征在于,所述3'保护基包括n-乙酰半乳糖胺基团、磷酸基团、-o-nh2、叠氮基、氰乙基、烯丙基或2-硝基苄基;所述5'保护基包括羟基、氢或甲基。

17.根据权利要求1至15中任一项所述的生物合成方法,其特征在于,所述底物中包括一个或多个非天然核苷酸,所述非天然核苷酸包括:具有核糖2'位修饰、核糖骨架修饰、碱基修饰或磷酸骨架修饰中的一种或多种的核糖核苷酸;

18.一种grna,其特征在于,所述grna包括利用权利要求1至17中任一项所述的生物合成方法制备获得的所述grna。


技术总结
本发明提供了一种gRNA及其生物合成方法,适用于gRNA合成领域。其中,该生物合成方法包括:利用RNA连接酶将不同底物的3'端和5'端连接形成磷酸二酯键,形成gRNA,gRNA包括天然gRNA或非天然gRNA,底物的数量≥2;底物的连接位点位于gRNA的茎环结构互补区域、茎环结构环状区域或茎环结构间的连接区域中的任意一个或多个位置,底物的内部或底物之间能够进行碱基互补配对,形成gRNA的二级结构;RNA连接酶包括RNA连接酶家族1、2或3中任意的一种或多种酶。能够解决现有技术中合成gRNA纯度低的问题。

技术研发人员:洪浩,詹姆斯·盖吉,张娜,焦学成,庞会宁,刘芳,马翠萍,王召帅,贾旭,崔丽心,朱文轩,赵晓岚
受保护的技术使用者:吉林凯莱英医药化学有限公司
技术研发日:
技术公布日:2024/1/16
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