一种反硝化聚磷菌微生物制剂的制备方法及应用

本发明属于微生物，具体涉及一种反硝化聚磷菌微生物制剂的制备方法及应用。

背景技术：

1、养殖业是福建省的优势产业，随着集约化养殖水平的不断提高，其中仅福建省鳗鱼养殖场日用水量和养殖尾水排放量均达500万吨以上。若鳗鱼场的养殖废水未经处理直接外排容易造成附近流域氮、磷超标而富营养化。目前，污水生物除磷通常采用生物除磷、化学除磷或两者相结合方式。化学法除磷消耗大量药剂，形成的化学污泥难以处理。生物除磷具有经济性，同时可利用生物除磷过程中的富磷上清液或者含磷污泥进行磷资源的分离和回收。因此从磷资源回收角度，生物除磷更具有优势。水产养殖废水属低浓度含磷废水，特别是废水中的磷含量在2～5mg/l时处理存在困难，关键问题是低浓度废水中碳磷比例严重失调，微生物较难生长，生物除磷作用不能得以有效发挥。

2、发明人通过对福建省内(比如南平市、福清市、罗源县等地)多家鳗鱼养殖场采样，其中鳗鱼场废水的cod浓度为78-118mg/l，nh4+-n浓度为4.3-28mg/l，tp浓度为0.48-18.9mg/l。利用高通量测序技术，对鳗鱼场养殖废水及一级沉淀池污泥中的微生物群落结构及组成比例进行分析，数据显示黄杆菌属(flavobacterium)占总微生物群落总数1.2-4.2％，红杆菌属(rhodobacter)占比为1.1％-3.5％，热单胞菌属(thermomonas)占比为0.1％-6％，dechloromonas占比为0.2％-0.6％，还有其它的微生物菌株等，这些菌属均为养殖废水中的主要微生物菌属。进一步采用高效菌株分离技术及测序技术，发现鳗鱼场养殖废水及一级沉淀池污泥微生物群落中具有反硝化聚磷作用的菌种主要是：(1)基因组中含有聚磷酸盐激酶1基因ppk1、亚硝酸还原酶基因nirk及氧化亚氮还原酶基因nosz的ramlibactermonticola；(2)基因组中含有聚磷酸盐激酶1基因ppk1、亚硝酸还原酶基因nirk及氧化亚氮还原酶基因nosz的人参黄杆菌(flavobacteriumginsengisoli)；(3)基因组中含有聚磷酸盐激酶1基因ppk1及亚硝酸还原酶基因nirk的托霍尼假单胞菌(pseudomonas tohonis)；(4)基因组中含有聚磷酸盐激酶1基因ppk1及氧化亚氮还原酶基因nosz的paenacidovoraxcaeni；(5)基因组中含有聚磷酸盐激酶1基因ppk1、亚硝酸还原酶基因nirk及氧化亚氮还原酶基因nosz的尾黄杆菌(flavobacteriumcauense)；(6)基因组中含有聚磷酸盐激酶1基因ppk1、亚硝酸还原酶基因nirk及氧化亚氮还原酶基因nosz的嗜糖假单胞菌(pelomonas saccharophila)；(7)基因组中含有聚磷酸盐激酶1基因ppk1及氧化亚氮还原酶基因nosz的薄荷脱氯单胞菌(dechloromonas hortensis)；(8)基因组中含有聚磷酸盐激酶1基因ppk1及氧化亚氮还原酶基因nosz的acidovorax soli。

3、彭永臻院士团队已有报道，证实dechloromonas、acinetobacter、pseudomonas等菌属具有除磷性能，dechloromonas还具有反硝化除磷性能。huang等报道了一株新型pseudomonas aeruginosa菌株能同步进行异养硝化-好氧反硝化和好氧除磷。吕冉等报道嗜热单胞菌(thermomonas)、红杆菌(rhodobacter)为好氧反硝化菌。

4、由此，我们通过不同生物技术手段确定了鳗鱼场养殖废水中具有反硝化聚磷作用的主要微生物菌株，这些菌株具有反硝化聚磷功能基因，人工培养这些微生物菌株，以微生物有效活菌数及反硝化聚磷功能基因拷贝数(聚磷酸盐激酶1基因ppk1、亚硝酸还原酶基因nirk及氧化亚氮还原酶基因nosz)作为表征指标制备成微生物制剂，再应用于鳗鱼场养殖废水处理。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种反硝化聚磷菌微生物制剂的制备方法及应用。本发明采用活性炭纤维毡作为反硝化聚磷菌的载体，该载体不仅为微生物提供生存空间，而且便于回收再利用。本微生物制剂具有成本低，可覆盖应用于不同氮磷浓度的鳗鱼场养殖废水，可有效解决鳗鱼养殖行业废水排放难题。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种反硝化聚磷菌微生物制剂的制备方法，其包括以下步骤：

4、s1：活性炭纤维毡载体的制备：

5、s1-1：将生物质材料烘干后放入马弗炉中，在氮气保护下进行煅烧，得到煅烧后的生物质材料；

6、s1-2：用压力机将煅烧后的生物质材料厚度压制到3-4mm，得到活性炭纤维毡载体；

7、s2：微生物复合菌剂的制备：

8、s2-1：制备微生物菌株活化培养基；

9、s2-2：分别将具有反硝化及聚磷作用的ramlibacter monticola、人参黄杆菌(flavobacterium ginsengisoli)、托霍尼假单胞菌(pseudomonas tohonis)、paenacidovorax caeni、尾黄杆菌(flavobacterium cauense)、嗜糖假单胞菌(pelomonassaccharophila)、薄荷脱氯单胞菌(dechloromonas hortensis)、acidovorax soli活化后接种到微生物菌株活化培养基中，培养至对数生长期；其中，所述ramlibacter monticola、人参黄杆菌(flavobacterium ginsengisoli)、尾黄杆菌(flavobacterium cauense)、嗜糖假单胞菌(pelomonas saccharophila)基因组中均含有聚磷酸盐激酶1基因ppk1、亚硝酸还原酶基因nirk及氧化亚氮还原酶基因nosz，所述托霍尼假单胞菌(pseudomonas tohonis)基因组中含有聚磷酸盐激酶1基因ppk1及亚硝酸还原酶基因nirk，所述paenacidovoraxcaeni、薄荷脱氯单胞菌(dechloromonas hortensis)、acidovorax soli基因组中均含有聚磷酸盐激酶1基因ppk1及氧化亚氮还原酶基因nosz；

10、s2-3：将处于对数生长期的菌液离心，收集菌体用0.9wt％的无菌生理盐水洗涤，再用0.9wt％的无菌生理盐水稀释至原体积，得到各菌株的悬浊液；

11、s2-4：将ramlibacter monticola悬浊液、人参黄杆菌(flavobacteriumginsengisoli)悬浊液、托霍尼假单胞菌(pseudomonas tohonis)悬浊液、paenacidovoraxcaeni悬浊液、尾黄杆菌(flavobacterium cauense)悬浊液、嗜糖假单胞菌(pelomonassaccharophila)悬浊液、薄荷脱氯单胞菌(dechloromonas hortensis)悬浊液、acidovoraxsoli悬浊液混合，得到微生物复合菌剂；所述微生物复合菌剂中的总有效活菌数为1.0×108～1.2×108cfu/ml；

12、s3：共培养：

13、将微生物复合菌剂和活性炭纤维毡载体接入鳗鱼养殖废水中，在28℃、120rpm条件下共培养72～96h后，捞出活性炭纤维毡载体置于30℃烘干至恒重，得到反硝化聚磷菌微生物制剂，在4℃条件下保存；每克所述反硝化聚磷菌微生物制剂中聚磷酸盐激酶1基因ppk1拷贝数为2.0×105～1.0×106，亚硝酸还原酶基因nirk拷贝数为2.0×105～6.0×106，氧化亚氮还原酶基因nosz拷贝数为5.0×104～1.0×105。

14、进一步的，上述生物质材料为剩余污泥、菌菇渣、猪粪中的一种或多种。

15、进一步的，上述煅烧的制度为：控制马弗炉内起始温度为105～250℃，以每分钟升温3℃的速度升温至300～400℃，再以每分钟升温2℃的速度升温至500～600℃，然后以每分钟升温1℃的速度升温至800～1000℃并保温12～18h，最后自然冷却至室温。

16、进一步的，上述活性炭纤维毡载体的比表面积≥1300m2/g，拉力强度≥20n，孔径5-克重≥110g/m2。

17、进一步的，上述微生物菌株活化培养基的配方为：取酵母粉0.5g、胰蛋白胨0.5g、丙酮酸钠0.3g、磷酸氢二钾0.3g、酸水解酪蛋白0.5g、淀粉0.5g、硫酸镁0.03g、葡萄糖0.5g混合，用蒸馏水溶解并定容至1.0l，调节ph值到7.0，置于100kpa、121℃条件下灭菌30min。

18、利用上述的制备方法获得的反硝化聚磷菌微生物制剂。

19、上述的反硝化聚磷菌微生物制剂在处理鳗鱼养殖废水中的应用。

20、一种使用上述的反硝化聚磷菌微生物制剂处理鳗鱼养殖废水的方法，其是将反硝化聚磷菌微生物制剂投入到鳗鱼养殖废水中。

21、本发明的显著优点在于：

22、(1)本发明反硝化聚磷菌微生物制剂处理的鳗鱼场养殖废水中的cod浓度为88～118mg/l，nh4+-n浓度为12.7～28mg/l，tp浓度为2.9～14.8mg/l。这一水质指标可以覆盖整个福建省鳗鱼养殖场的水质指标，因此本微生物制剂的适应性范围较广，可以解决鳗鱼场养殖行业的废水达标排放问题。

23、(2)本发明以微生物有效活菌数及每克活性炭纤维毡载体中反硝化聚磷功能基因拷贝数(ppk1、nirk及nosz)作为反硝化聚磷菌微生物制剂的表征指标，这些指标有助于制备较为标准化的微生物制剂，且便于根据不同的水质指标制定不同的鳗鱼场养殖废水处理方案。

24、(3)反硝化聚磷菌如以dechloromonas为代表功能菌，可利用挥发性脂肪酸作为碳源，以硝酸盐作为电子受体进行缺氧吸磷。该功能菌作用机理和传统的厌氧释磷/好氧吸磷机理颇为相似，在厌氧条件下，反硝化聚磷菌进行厌氧释磷，即通过利用胞内聚合磷酸盐水解释放的能量，吸收污水中的挥发性脂肪酸至胞内转化为内碳源pha贮存，同时释放正磷酸盐到水中；在缺氧条件下，反硝化聚磷菌则以硝酸盐作为电子受体，氧化细胞内贮存的pha，这部分产生的能量大部分用于同化作用，另一部分则被用于过量吸收污水中的磷酸盐以聚磷酸盐的形式贮存在细胞内，同时硝酸盐被还原为氮气。

25、(4)本发明采用共培养法制备反硝化聚磷菌微生物制剂，将具有反硝化及聚磷作用的ramlibacter monticola、人参黄杆菌(flavobacterium ginsengisoli)、托霍尼假单胞菌(pseudomonas tohonis)、paenacidovorax caeni、尾黄杆菌(flavobacteriumcauense)、嗜糖假单胞菌(pelomonas saccharophila)、薄荷脱氯单胞菌(dechloromonashortensis)、acidovorax soli和活性炭纤维毡载体在鳗鲡养殖废水中共培养，使得这些菌能够进一步适应鳗鲡养殖废水环境；同时，制备方法简单、成本低，微生物活性高，具有高效吸附和降解污染物的特点，而且对环境友好，不会造成二次污染。