一种原位原发肿瘤动物模型及其构建方法和应用与流程

本发明涉及肿瘤动物模型，具体涉及一种原位原发肿瘤动物模型及其构建方法和应用。

背景技术：

1、近二十年来，肿瘤的临床治疗取得突破性进展，但仍有很多患者无法得到有效治疗。因此，深入了解肿瘤发生机制，找到其中的关键作用因子，进而研发更加有效的治疗手段，显得尤为迫切。而肿瘤动物模型在探究肿瘤发生发展机制、研发新药物方面扮演着至关重要角色。

2、目前常用的动物肿瘤模型包括：移植瘤模型(同种移植、异种移植和患者来源的异种移植)、诱导肿瘤模型(例如，通过物理、化学和生物因素诱导)、自发肿瘤模型和基因编辑肿瘤模型。

3、最常见的基因编辑肿瘤动物模型通过在受精卵或胚胎干细胞中进行基因改造，敲入癌基因或者敲除抑癌基因，从而获得可以遗传的基因编辑动物。基因编辑肿瘤动物模型的构建比较复杂，繁育周期和成瘤时间长，且成本较高。

4、其他现有技术通过尾静脉注射质粒溶液，构建肝癌动物模型，该方法虽然简单、快捷、成本低，但只能形成肝癌，无法在其他器官或目标组织形成肿瘤。

5、并且，基于质粒转染构建肿瘤动物模型的过程中，质粒很难在动物体内发生转染，一般需要额外借助电转染或者通过病毒转染等方式，操作较为复杂。

6、因此，需要一种操作简单、成本低、应用范围广、能够提高转染效率的肿瘤动物模型构建方法。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种原位原发肿瘤动物模型及其构建方法和应用。相比移植瘤动物模型，此模型具有明确的基因驱动背景，能够有效模拟动物肿瘤发生发展的真实过程。相比基因编辑动物，此模型耗时短、成本低、造模简单。相比尾静脉注射质粒制作肝癌模型，此方法可以在多种目标器官或目标组织中形成肿瘤。本发明提出一种全新的肿瘤动物模型构建方法，通过直接注射癌症相关基因表达质粒和转座酶质粒的混合溶液到目标器官或目标组织中即可诱发原位肿瘤形成。

2、本说明书实施例之一提供了一种构建原位原发肿瘤动物模型的方法，用于非诊断或治疗目的，包括：配制至少一种质粒混合溶液，其中，所述至少一种质粒混合溶液包含一个或多个表达质粒与转座酶质粒，所述表达质粒中的每一个包括至少一部分癌症相关基因的序列，并含有转座酶识别位点；原位注射所述至少一种质粒混合溶液至目标器官或目标组织内，以获取至少一种原位原发肿瘤动物模型。

3、在一些实施例中，所述表达质粒由以下过程构建得到，所述过程包括：获得与所述癌症相关基因对应的至少一个dna片段；将所述至少一个dna片段分别插入到至少一个含有所述转座酶识别位点的初始表达质粒中，得到所述表达质粒。

4、在一些实施例中，所述构建原位原发肿瘤动物模型的方法还包括：在所述癌症相关基因的所述表达质粒中插入荧光标记基因或生物发光基因。

5、在一些实施例中，所述癌症相关基因包括癌基因和/或抑癌基因。

6、在一些实施例中，所述癌基因至少包括akt、notch1、notch2、nicd(notch1或notch2的胞内片段)、myc、nras、kras、hras、met、bmi1、egfr、znf217、ikzf3、ccnd1、fgf19、fak、yap、β-catenin、nrf2、p62、smad7、ctnnb1、jak1、nfe2l2或pik3ca中的一个或多个。

7、在一些实施例中，所述癌基因为myc、nicd、ctnnb1、pik3ca、nras、egfr、kras、jak1或akt，其中，所述myc包含与seq id no：1所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，所述nicd包含与seq id no：2所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，所述ctnnb1包含与seq id no：3所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，所述pik3ca包含与seq id no：4所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，所述nras包含与seq id no：5所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，所述egfr包含与seq id no：6所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，所述kras包含与seq idno：7所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，所述jak1包含与seq id no：8所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，所述akt包含与seq id no：9所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。

8、在一些实施例中，所述抑癌基因至少包括tp53、arid1a、lrp1b、kmt2d、kmt2c、fat4、cdh1、kmt2b、brca2、pten、ptprd、cdkn2a、cdkn2b、prkn、mtap、fhit、smad4、irf2、tbx3、fbxw7、axin1、spry2、或rb中的一个或多个。

9、在一些实施例中，所述至少一部分癌症相关基因的序列用于编码sgrna，所述sgrna用于将cas蛋白引导至所述抑癌基因，实现所述抑癌基因的基因敲除；其中，编码用于敲除所述tp53的sgrna至少包括seq id no：10所示的核苷酸序列；编码用于敲除所述rb1的sgrna至少包括seq id no：11所示的核苷酸序列；编码用于敲除所述pten的sgrna至少包括seq id no：12所示的核苷酸序列。

10、cas蛋白包括但不限于cas9、cas12、cas13等。

11、在一些实施例中，原位注射所述质粒混合溶液2周后，所述目标器官或目标组织内形成所述原位原发肿瘤。

12、在一些实施例中，所述原位原发肿瘤的成瘤率大于70％。

13、在一些实施例中，所述原位注射的注射体积小于400μl每20g体重。

14、在一些实施例中，所述表达质粒为真核表达载体；所述转座酶识别位点位于所述癌症相关基因两侧，用于在所述转座酶质粒表达的转座酶的作用下，将所述癌症相关基因整合到目标器官或目标组织的细胞的基因组上。

15、在一些实施例中，所述表达质粒包括pt3-ef1α、pt3-ef5α、pbudce4.1、pcdna3.1、pegfp-n1、px330或pbr322。

16、在一些实施例中，所述质粒混合溶液中至少包含3μg myc基因的表达质粒、3μgnicd基因的表达质粒以及0.5μg所述转座酶质粒。

17、在一些实施例中，所述质粒混合溶液中至少包含4μg akt基因的表达质粒或5μgmyc基因的表达质粒、5μg nicd基因的表达质粒以及1μg所述转座酶质粒。

18、本说明书实施例之一提供了一种按照上述构建原位原发肿瘤动物模型的方法构建的原位原发肿瘤模型。

19、本说明书实施例之一提供了一种原发肿瘤动物模型在与癌症相关的机制研究、药物筛选、药效评价、或药物毒性试验中的应用。

20、在一些实施例中，所述癌症包括肺癌、乳腺癌、脑癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌、脾脏癌、骨肉瘤、肝癌、肠癌、膀胱癌、或肾癌。