一种高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒的制作方法

本发明属于分子生物学检测，尤其是涉及一种高纯度粪便病原体dna或rna提取试剂盒。

背景技术：

1、肠道菌群是机体的重要组成部分，包括潜在能源的发酵、短链脂肪酸的产生以及致癌物质的激活或失活，其菌群结构数量和种类的变化与机体的健康状况息息相关，我们有必要通过各种分析方法来研究宿主与体内菌群之间的相互作用关系。

2、与培养方法相比，微生物临床样本的分子分析可以提供各种优势，包括检测更广泛的目标生物，以及更高的灵敏度和特异性。与血液或其他临床样本相比，粪便中复杂的微生物菌群、可变的稠度以及可变的内源性和膳食成分使病原体dna/rna提取特别困难，然而从这种异质复杂的样本中提取高纯度的dna/rna，是下游进一步分析的关键(如感染病原体的pcr分析)。针对粪便病原体的检测方法包括免疫学检测法、生物传感器法和核酸检测法三种。免疫学检测法利用抗原-抗体杂交反应，能够快速检测目标物；生物传感器检测法主要依靠光学和电化学分析技术，样品制备简单，能够实现间测系统的微型化；而核酸检测法通过对目标序列进行放大扩增，可以检测目标病原体的特定基因，检测准确度高。

3、目前，对于粪便病原体提取试剂，存在组分复杂、提取纯度低以及不能适用于不同形状粪便的技术问题。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术的不足，提供了一种高纯度粪便病原体dna或rna提取试剂盒。组成成分简单、操作方法简便且提取核酸准确率高，能够快速、简便及高纯度的实现粪便dna/rna的提取。

2、为此，本发明提供了一种高纯度粪便病原体dna或rna提取试剂盒，包括样本前处理液、裂解液和洗涤液1，所述样本前处理液包括醋酸钾、盐酸胍和tween80。

3、在本发明的一些实施方式中，所述样本前处理液中醋酸钾的浓度为0.5-1.5m。在一些例子中，所述样本前处理液中醋酸钾的浓度可以但不限于为0.5m、1.0m或1.5m。优选地，所述样本前处理液中醋酸钾的浓度为1.0m。

4、在本发明的一些实施方式中，所述样本前处理液中盐酸胍的浓度为1.0-5.0m，在一些例子中，所述样本前处理液中盐酸胍的浓度可以但不限于为1m、2m、3m、4m或5m。优选地，所述样本前处理液中盐酸胍的浓度为5.0m。

5、在本发明的一些实施方式中，所述样本前处理液中tween80的质量百分含量为15％-25％。在一些例子中，所述样本前处理液中tween80的质量百分含量可以但不限于为15％、20％或25％。

6、在本发明的一些实施方式中，所述裂解液包括tris-hcl、edta、盐酸胍、十二烷基硫酸钠、np-40和异丙醇。

7、在本发明的一些实施方式中，所述裂解液中tris-hcl的浓度为0.05-0.2m。在一些例子中，所述裂解液中tris-hcl的浓度可以但不限于为0.05m、0.1m、0.15m或0.2m。

8、在本发明的一些实施方式中，所述裂解液中edta的浓度为0.02-0.6m。在一些例子中，所述裂解液中edta的浓度可以但不限于为0.02m、0.1m、0.2m或0.6m。

9、在本发明的一些实施方式中，所述裂解液中盐酸胍的浓度为4.0m。

10、在本发明的一些实施方式中，所述裂解液中十二烷基硫酸钠的质量百分含量为1％-4％。在一些例子中，所述裂解液中十二烷基硫酸钠的质量百分含量可以但不限于为1.0％、2％或4.0％。优选地，所述裂解液中十二烷基硫酸钠的质量百分含量为2％。

11、在本发明的一些实施方式中，所述裂解液中np-40的质量百分含量为0.5％-2％。在一些例子中，所述裂解液中np-40的质量百分含量可以但不限于为0.5％、1.0％或2.0％。优选地，所述裂解液中np-40的质量百分含量为1.0％。

12、在本发明的一些实施方式中，所述裂解液中异丙醇的体积比为30％-70％。在一些例子中，所述裂解液中异丙醇的体积比可以但不限于为30％、40％、60％或70％。

13、在本发明的一些实施方式中，所述洗涤液1包括tris-hcl、edta、碳酸氢钠、盐酸胍和异丙醇。

14、在本发明的一些实施方式中，所述洗涤液1中tris-hcl的浓度为0.04-0.2mol/l。在一些例子中，所述洗涤液1中tris-hcl的浓度可以但不限于为0.04m、0.16m或0.2m。

15、在本发明的一些实施方式中，所述洗涤液1中edta的浓度为0.02-0.1m。在一些例子中，所述洗涤液1中edta的浓度可以但不限于为0.02m、0.08m或0.1m。

16、在本发明的一些实施方式中，所述洗涤液1中碳酸氢钠的浓度为0.1-0.4m。在一些例子中，所述洗涤液1中碳酸氢钠的浓度可以但不限于为0.1m、0.2m或0.4m。优选地，所述洗涤液1中碳酸氢钠的浓度为0.2m。

17、在本发明的一些实施方式中，所述洗涤液1中盐酸胍的浓度为2.0m。

18、在本发明的一些实施方式中，所述洗涤液1中异丙醇的体积比为30％-60％。在一些例子中，所述洗涤液1中异丙醇的体积比可以但不限于为30％、40％、50％或60％。

19、在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括洗涤液2、洗脱液、蛋白酶k溶液和磁珠混合液。

20、在本发明的一些实施方式中，所述洗涤液2包括体积比为50％-80％的无水乙醇和0.2m的碳酸氢钠。在一些例子中，所述洗涤液2中无水乙醇的体积比可以但不限于为50％、60％、70％或80％。

21、在本发明的一些实施方式中，所述洗脱液包括10mm的tris-hcl和0.1mm的edta溶液。

22、在本发明的一些实施方式中，所述蛋白酶k溶液的浓度为15mg/ml。

23、在本发明的一些实施方式中，所述蛋白酶k溶液的使用量为10μl。

24、在本发明的一些实施方式中，所述磁珠混合液的浓度为20mg/ml。

25、在本发明的一些实施方式中，所述磁珠混合液中的磁珠表面包括但不限于羧基、氨基或硅羟基基团。优选地，所述磁珠混合液中的磁珠为硅羟基磁珠。

26、在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒的使用方法包括：使用天隆generotex96提取仪或其他同等类型的仪器上进行自动化提取，

27、在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒的使用方法，包括以下具体步骤：

28、s1：样本前处理

29、称取待测样品100-200mg或100-200μl，加入1ml样本前处理液，在70℃条件下加热5min后涡旋混匀10秒，15000rpm离心1min后获得样本上清液备用；

30、s2：根据提取样本的数量，在96深孔板的第1、7列中按顺序加入10μl蛋白酶k溶液、200μl前处理后的样本上清液、400μl裂解液；

31、s3：根据提取样本的数量，在96深孔板的第2、8列中加入500μl的磁珠混合液；添加磁珠混合液前需充分混匀磁珠，如提取的样本数量较多，建议每添加完8个样品孔重悬一次磁珠；

32、s4：根据提取样本的数量，在96深孔板的第3、9列中加入700μl的洗涤液1；

33、s5：根据提取样本的数量，在96深孔板的第4、10列中加入700μl的洗涤液2；

34、s6：根据提取样本的数量，在96深孔板的第6、12列中加入100μl的洗脱液。

35、利用天隆generotex96自动提取仪，generotex96核酸提取仪按以下程序进行自动化提取(注意：程序运行前需在深孔板第2和第8列放置搅拌套)：

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38、自动化程序结束后，将第6或12列的洗脱孔核酸产物转移至干净的无核酸酶离心管中。

39、本发明的有益效果：

40、(1)本发明的提取试剂盒，样本前处理液中醋酸钾与盐酸胍和tween80复配，提高了粪便样本中的病原体的多糖组分含量较多的样本的破坏力，能够有效地去除样本中的蛋白质、腐植酸、多糖、脂类等杂质，为后续提取步骤提供优质的保障。

41、(2)本发明的提取试剂盒，裂解液中采用十二烷基硫酸钠、np-40两种表面活性剂与tris-hcl、edta、盐酸胍和异丙醇复配进行使用，对样本中一些硫酸盐的菌类、腐生菌等有较强破坏力，使得核酸能够更高效的释放，可以远远提高裂解液对样品的裂解能力，尤其对复杂粪便样品作用较明显。

42、(3)本发明的提取试剂盒，洗涤液1中的碳酸氢纳的碱性作用强于现有技术常用中的醋酸钠，又能兼顾溶液中离子平衡，解决了对粘蛋白的洗涤能力不足以及洗脱效率的问题，且与tris-hcl、edta、盐酸胍和异丙醇复配，会对核酸上携带的杂质洗涤会更彻底。

43、(4)本发明的提取试剂盒，匹配天隆全自动核酸提取仪平台，裂解效率高，样本经过前处理，再经后续的自动化裂解消化，能够得到浓度更高、纯度更高的dna/rna核酸，为下游pcr等检测提供优质的质量保证，保证后续操作的准确性。