一种苹果早期落叶病菌跨界传递milRNA及其防治方法

本发明涉及植物分子生物学领域，具体说是一种苹果早期落叶病菌跨界传递milrna及其防治方法。

背景技术：

1、milrna介导的跨界调控在植物与病原体相互作用中起着重要作用。真菌milrna已被证明通过调节大丽花轮枝菌、稻瘟病菌和苹果腐烂病中的致病基因以参与植物侵染过程。然而，植物病原真菌的milrnas介导的跨界调控的功能和机制在很大程度上仍是未知的。苹果早期落叶病是苹果目前感染的较为严重的真菌性病害，包括苹果斑点落叶病(alternaria sp.mali，alt1)、苹果褐斑病(marssonina leaf spot，mls1)及苹果炭疽叶枯病(glomerella leaf spot，gls1)。苹果早期落叶病侵染苹果叶片后，会使苹果在生长早期发生落叶的现象，对苹果的产量形成巨大的影响，因此，探究苹果早期落叶病的致病机制及防治方法十分必要。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种苹果早期落叶病菌跨界传递的milrna及其防治方法。本发明通过比较苹果接种苹果斑点落叶病alternariasp.mali(alt1)前后milrna的表达差异，得到了一种苹果早期落叶病菌跨界传递milrna，命名为altmilr823。研究发现，与未接种alt1、gls1(glomerella leaf spot)与mls1(marssonina leaf spot)的gl-3相比，在接种了alt1、gls1与mls1后的gl-3中altmilr823的表达均上升。苹果叶片注射瞬时过表达altmilr823载体可增强苹果对alt1、gls1与mls1的易感性。另外，在接种了alt1、gls1与mls1的gl-3的叶片中可以观察到altmilr823的存在。随后，在gl-3的基因组dna中扩增得到了altmilr823的靶基因mdpecl4。进一步通过5‘race验证altmilr823在10-11位点靶向切割其靶基因mdpecl4。过表达靶基因后，在gl-3中接种alt1、gls1与mls1后，altmilr823的表达量下降。因此发明人通过过表达靶基因mdpecl4开发了抗早期落叶病的分子手段。

2、为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

3、一种苹果早期落叶病菌跨界传递的milrna(命名为altmilr823)，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no：1所示。

4、一种苹果早期落叶病菌跨界传递的milrna的初级转录本(命名为altmilr823)，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no：2所示。

5、一种检测苹果早期落叶病菌跨界传递milrna的原位杂交方法，其特征在于，包括如下步骤：

6、s1：取接菌48h后叶片和未接菌叶片，先分别在rnase浸泡15min，然后用ph 7.4的1×pbs洗涤3次；将处理后的叶片样品放置于4％多聚甲醛真空浸润15min，至样品下沉，变成半透明状，然后放到4℃冰箱过夜；

7、s2：所有样品用1×pbs冲洗3次，每次间隔5min。冲洗后的样品在添加20μg/ml蛋白酶k和0.5％triton-x的te缓冲液中37℃处理2-3h，以消化细胞内多余的rna酶和蛋白质，并渗透细胞以进入探针；

8、s3：经s2处理的样品在ph 7.4的1x pbs中冲洗3次，每次冲洗间隔5分钟；在室温下用0.2％甘氨酸浸泡5分钟，以终止蛋白酶活性；经甘氨酸处理后，样品用4％多聚甲醛固定5分钟，再次在1x pbs缓冲液中冲洗；

9、s4：将lna和fam修饰后的探针用50％甲酰胺中85℃变性3min，然后立即冰浴5min；

10、s5：将经s4处理的20μl浓度为35μm的探针溶液和作为无探针对照的20μl的50％甲酰胺溶液，分别连同80μl的杂交缓冲液加入到装有经s3处理的样品管中，50℃，300rpm过夜孵育；

11、s6：将0.2×ssc缓冲液加入经s5处理的样品管中，50℃，300rpm清洗30min，上述清洗重复一次；

12、s7：将包含0.1％碘化丙啶的0.2×ssc缓冲液加入经s6处理的样品管中，37℃，300rpm清洗5min；

13、s8：将包含0.1％碘化丙啶的0.2×ssc缓冲液加入经s7处理的样品管中，室温，300rpm清洗5min；

14、s9：用0.2×ssc缓冲液漂洗经s8处理的样品，去色。

15、在上述方案的基础上，所述的经lna和fam修饰后的探针的序列如seq id no：3所示。

16、一种苹果早期落叶病菌跨界传递milrna的靶基因(命名为mdpecl4)，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no：4所示。

17、一种植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体为包含检测早期落叶病菌跨界传递的milrna的pfgc5941载体。

18、一种工程菌，其特征在于，包含上述植物表达载体(该植物表达载体为包含检测早期落叶病菌跨界传递的milrna的pfgc5941载体)。

19、一种植物表达载体，其特征在于，包含上述靶基因的pfgc5941载体。

20、一种工程菌，其特征在于，包含上述的植物表达载体(该植物表达载体为包含上述靶基因的pfgc5941载体)。

21、一种提高苹果植株对苹果早期落叶病菌抗性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

22、s1：通过ctab方法提取感病苹果总rna；

23、s2：将经s1提取的总rna逆转录成cdna；

24、s3：利用s2得到的逆转录的模板和rt-pcr引物克隆权利要求5所述的靶基因；

25、s4：将s3得到的靶基因插入pfgc5941载体上的bamhi和ncoi两个酶切位点中，转入大肠杆菌dh5α中；

26、s5：提取经s4构建的过表达靶基因载体质粒；

27、s6：将s5提取的质粒转入农杆菌中，涂布于加有抗生素的固体yep培养基上，将平板置于28℃恒温培养箱中倒置培养24-48h；上述抗生素包含50mg/l kana，20mg/l rif；

28、s7：从经s6培养的农杆菌菌板挑取单斑，加入到2ml包含50mg/lkana，20mg/l rif的yep液体培养基中，28℃，180rpm培养过夜；

29、s8：取80μl经s7培养的农杆菌菌液，加入到4ml包含50mg/lkana，20mg/l rif及10μm乙酰丁香酮的yep液体培养基中，28℃，180rpm培养12-16h；

30、s9：将经s8培养的农杆菌菌液室温10000rpm离心1min，除去培养基；用1-2ml悬浊液经涡旋震荡悬浮上述菌液；取经震荡悬浮的菌液10μl加入990μl悬浊液得菌体悬浊液，用分光光度计测定其od600，将菌体悬浊液调整至od600＝1.0，室温静置2-5h；上述悬浊液中包括：ph调至5.2的10mm mes-koh，10mm mgcl2，100μm乙酰丁香酮；

31、s10：将s9得到的菌液使用前经涡旋震荡或移液枪吸打悬浮起菌体，然后用去针头的1ml无菌注射器吸取上述菌液，避开叶脉，用上述1ml注射器针头在苹果叶片上开小孔后，将菌体液注射入叶片中，每个叶片注射1-2个孔；

32、s11：注射农杆菌4天后观察叶片。

33、本发明所述的一种苹果早期落叶病菌跨界传递milrna及其防治方法，其有益效果为：

34、本发明提供的altmilr823的靶基因mdpecl4在改良苹果品种的应用，通过将mdpecl4过表达在植物表达载体上，导入苹果早期落叶病感病苹果中，可提高植物的抗病性。由于mdpecl4是通过过表达苹果自身基因发挥功能，相比转入外源抗性基因的苹果植株更安全，且更易于被消费者接受