一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

本发明涉及微生物代谢工程，尤其涉及一种高产l-半胱氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术：

1、l-半胱氨酸是一种极性不带电的含硫氨基酸，是大多数生物体内还原硫进入细胞代谢的唯一代谢入口。低分子硫醇及其二硫化物是细胞的关键成分，在新陈代谢和抗氧化防御网络中发挥着许多重要作用。此外，微生物利用半胱氨酸作为硫胺素(维生素b1)、生物素(维生素b7或b8)、硫辛酸、辅酶a和辅酶m的前体，它们是酶反应中的重要辅助因子。l-半胱氨酸还被广泛应用于食品、医药、化妆品、生物技术等领域。例如，它可以被用作面包、烤饼等食品中的天然改良剂，可以增加食品的美味和口感。此外，l-半胱氨酸还可以作为一种药物来治疗某些疾病，如肺炎、心血管疾病等。在化妆品中，l-半胱氨酸可以作为一种保湿剂，为皮肤提供保湿和滋润。

2、l-半胱氨酸是蛋白质、谷胱甘肽和许多其他生物分子的重要组成部分，也是氧化还原活性巯基的来源。然而，l-半胱氨酸对细胞具有很强的毒性，一部分原因是因为它能够促进fenton反应，产生强破坏性的羟基自由基，毒性问题严重限制了l-半胱氨酸的工业化生产。所以，自然界中微生物通过协调l-半胱氨酸的生物合成、利用、氧化和运输来维持细胞内低水平的l-半胱氨酸浓度。其中，膜蛋白转运调控是菌株代谢及产物合成过程中的重要环节。在大肠杆菌的内膜和外膜上，存在主要的l-半胱氨酸外转运蛋白eama、eamb、tolc，内转运蛋白yean，主要的l-胱氨酸外转运蛋白yije，内转运蛋白ydjn、fliy-yesc。其中eama、ydjn和fliy-yesc参与组成“l-半胱氨酸/l-胱氨酸穿梭系统”。

3、l-胱氨酸是由两个半胱氨酸分子氧化形成，在细胞内还原条件下可逆转化为半胱氨酸。在l-半胱氨酸/l-胱氨酸穿梭系统，l-胱氨酸输入和l-半胱氨酸输出通过紧密的协调，来实现细胞周质空间的氧化还原平衡。内源性l-半胱氨酸通过eama输出到周质，被周质空间中的h2o2氧化成l-胱氨酸，缓解了周质空间中h2o2因缺少相应的过氧化氢酶而无法被清除造成的氧化压力。然后l-胱氨酸通过ydjn或以fliy依赖的方式输入回细胞质。随后，l-胱氨酸在细胞质内可逆地转化为l-半胱氨酸，继续进入下一次循环。l-半胱氨酸/l-胱氨酸穿梭系统在大肠杆菌l-半胱氨酸合成限制的条件下，有效地应对了周质空间的氧化压力，在大肠杆菌抵抗氧化应激中扮演着重要的角色。在l-半胱氨酸工程菌株中，l-半胱氨酸的过量生产缓解了大肠杆菌中l-半胱氨酸合成受限的问题，然而其中l-半胱氨酸/l-胱氨酸穿梭系统的胱氨酸回流通道可能会限制l-半胱氨酸胞外积累。

4、因此，对l-半胱氨酸工程菌株中穿梭系统进行系统性研究，提出能够有效地提高l-半胱氨酸产量的l-半胱氨酸/l-胱氨酸穿梭系统的重构策略，对于l-半胱氨酸的的工业化生产具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种高产l-半胱氨酸的基因工程菌及其构建方法，并将其应用于发酵生产l-半胱氨酸，以克服现有技术中存在的l-半胱氨酸生产菌株的l-半胱氨酸/l-胱氨酸穿梭系统不利于l-半胱氨酸的合成与转运，导致在发酵生产l-半胱氨酸过程中菌株的产量较低的问题。

2、为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

3、第一方面，本技术提供了一种高产l-半胱氨酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：

4、(1)以菌株e.coli w3110 eyc作为出发菌株，过表达其基因组中的基因eama、基因eamb和基因tolc，并敲除其基因组中的基因ydjn和基因yean，获得工程菌e.coliw3110eyc::eama::eamb::tolcδydjnδyean；

5、(2)构建载体质粒ptrc99a-cysef，并导入至工程菌e.coli w3110eyc::eama::eamb::tolcδydjnδyean中，获得工程菌e.coli w3110eyc::eama::eamb::tolcδydjnδyean/ptrc99a-cysef，即为所述高产l-半胱氨酸的基因工程菌。

6、本发明通过对l-半胱氨酸和l-胱氨酸的系统性研究，即：首先通过对l-胱氨酸和l-半胱氨酸通道蛋白的系统研究，确定潜在的代谢靶点；随后在不影响细胞抵抗氧化压力的前提下，通过合理的强化穿梭系统中l-半胱氨酸和l-胱氨酸的输出通道，弱化其输入通道，实现l-半胱氨酸/l-胱氨酸穿梭系统的重构，最终构建获得了一种高产l-半胱氨酸的基因工程菌株e.coli w3110 eyc::eama::eamb::tolcδydjnδyean/ptrc99a-cysef。

7、为了得到本发明中所提出的基因工程菌株e.coli w3110eyc::eama::eamb::tolcδydjnδyean/ptrc99a-cysef，申请人对大肠杆菌l-半胱氨酸/l-胱氨酸穿梭系统的重构进行了一系列研究，具体研究内容包括：

8、(1)选择生产半胱氨酸的实验室保藏工程菌株e.coli w3110 eyc作为出发菌株(购自中国典型培养物保藏中心，保藏编号cctcc no：m 20191026，已在cn 111019877a中公开)；(2)在(1)获得的菌株中，利用crispr/cas9基因编辑技术过表达l-半胱氨酸/l-胱氨酸穿梭系统中参与l-半胱氨酸外转运的基因：基因eama、eamb和tolc，来加强l-半胱氨酸的外转运。通过组合过表达比较了上述基因对l-半胱氨酸的生产的影响，获得最有利于l-半胱氨酸合成的外转运蛋白的组合；

9、(3)在(2)获得的菌株中，利用crispr/cas9基因编辑技术过表达l-半胱氨酸/l-胱氨酸穿梭系统中参与l-胱氨酸外转运的基因yije，来加强l-胱氨酸的外转运；

10、(4)在(1)获得的菌株中，利用crispr/cas9基因编辑技术，敲除l-半胱氨酸/l-胱氨酸穿梭系统中参与l-半胱氨酸和l-胱氨酸内转运的基因：基因ydjn、fliy和yean，来削弱l-半胱氨酸的摄取。通过组合敲除比较了上述基因对l-半胱氨酸的生产的影响，获得最有利于l-半胱氨酸合成的内转运蛋白的组合；

11、(5)基于(2)～(4)中的研究结果，在(1)获得的菌株中，通过crispr/cas9基因编辑技术，合理的强化穿梭系统中l-半胱氨酸和l-胱氨酸的输出通道，弱化其输入系统，加强产物l-半胱氨酸的外运，阻断l-胱氨酸的回流，实现l-半胱氨酸/l-胱氨酸穿梭系统的重构。该实验涉及基因包括基因eama、eamb、tolc、ydjn和yean；

12、(6)在(5)获得的菌株中，对其胞内过氧化氢含量和mda水平进行检测以及对氧化还原相关基因和l-半胱氨酸合成途径相关基因进行实时荧光定量逆转录pcr，进一步了解将l-半胱氨酸/l-胱氨酸穿梭系统进行重构对产物合成和菌体应对氧化压力的能力的影响。所述基因包括基因gsha、ahpc、dsba、dsbb、kate、katg、cydd、cydc、soda、sodb、sodc、cysb、cysm、cysk、fliy。

13、作为优选，所述基因eama的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述基因eamb的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述基因tolc的核苷酸序列如seq id no.3所示。

14、作为优选，所述基因ydjn的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述基因yean的核苷酸序列如seq id no.7所示。

15、作为优选，所述质粒ptrc99a-cysef的核苷酸序列如seq id no.9所示。

16、作为优选，所述基因eama、基因eamb和基因tolc由启动子trc启动，所述启动子trc的核苷酸序列如seq id no.8所示。

17、此外，上述基因yije的核苷酸序列如seq id no.4所示，上述基因fliy的核苷酸序列如seq id no.6所示。

18、第二方面，本技术提供了一种用于构建以上任意一项所述的高产l-半胱氨酸的基因工程菌的方法，以菌株e.coli w3110 eyc作为出发菌株，包括以下步骤：

19、(1)应用crispr/cas9基因编辑技术将基因eama、基因eamb和基因tolc的原始启动子替换成trc启动子，获得工程菌e.coli w3110 eyc::eama::eamb::tolc；

20、(2)应用crispr/cas9基因编辑技术将工程菌e.coli w3110 eyc::eama::eamb::tolc基因组上的基因ydjn和基因yean敲除，进一步获得工程菌e.coli w3110eyc::eama::eamb::tolcδydjnδyean；

21、(3)以ptrc99a质粒为模版，构建载体质粒ptrc99a-cysef，并导入至工程菌e.coliw3110eyc::eama::eamb::tolcδydjnδyean中，获得工程菌e.coli w3110eyc::eama::eamb::tolcδydjnδyean/ptrc99a-cysef，即为所述高产l-半胱氨酸的基因工程菌。

22、第三方面，本技术提供了以上任意一项所述的高产l-半胱氨酸的基因工程菌或者以上所述的方法构建的高产l-半胱氨酸的基因工程菌在微生物发酵制备l-半胱氨酸中的应用。

23、作为优选，将所述基因工程菌接种至发酵培养基，在28～37℃，150-200rpm条件下发酵培养，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到l-半胱氨酸。

24、作为优选，所述发酵培养前先在培养基中30～37℃，150～200rpm条件下培养12～24h，再接种至发酵培养基。

25、作为优选，所述发酵培养基组成包括：葡萄糖20～30g/l、(nh4)2so45～10g/l、kh2po42～5g/l、na2s2o35～10g/l、酵母提取物5～10g/l、na2hpo410～15g/l、蛋白胨1～5g/l，1ml/l微量元素溶液，溶剂为去离子水，ph值自然；微量元素溶液组成为：300～500g/lmgso4·8h2o，2～5g/l mnso4·8h2o，2～5g/l znso4·7h2o，2～8g/lfe2so4，溶剂为去离子水。

26、本技术具有以下有益效果：

27、本发明在不影响细胞抵抗氧化压力的前提下，通过合理的强化穿梭系统中l-半胱氨酸和l-胱氨酸的输出通道，弱化其输入通道，实现了l-半胱氨酸/l-胱氨酸穿梭系统的重构，构建出了一种高产l-半胱氨酸的大肠杆菌基因工程菌株，该基因工程菌有效地提高了l-半胱氨酸的产量；此外，通过对穿梭系统改造菌株的氧化还原状态的相关检测发现，本发明对l-半胱氨酸/l-胱氨酸穿梭系统向加强产品生产方向的改造不仅增强了l-半胱氨酸的产量，并在一定程度上缓解细胞的生长抑制，降低了细胞面临的氧化压力，为后续工业化的微生物发酵法生产l-半胱氨酸奠定了基础。