一种冻干保护剂及含有其的混合液或乳杆菌冻干制品的制作方法

本发明属于微生物，具体涉及一种冻干保护剂及含有其的混合液或乳杆菌冻干制品。

背景技术：

1、乳杆菌广泛分布于含有碳水化合物的动植物发酵产品中，乳酸杆菌是人体肠道内的正常菌群群员，含有乳酸杆菌的微生态制剂，也广泛应用于临床，常用于调整微生态失调，保持生态平衡，提高人体的健康水平，以达到防病、治病的效果。目前国内外乳杆菌产品不是很多，绝大多数乳杆菌制剂存在一个需要解决的非常关键的问题：乳杆菌对环境温度、氧气、湿度非常敏感。产品在常温下货架期寿命非常短，一般需要冷链运输并在低温储存下销售，这影响产品的应用方式及效果，另外还提高能耗。因此乳杆菌常温稳定性的解决关系到微生态制剂更好和更广泛的应用、以及提高生产企业的生产效率，有着极大的市场竞争力。

2、乳杆菌与其他微生物类似，直接冻干会对细胞造成不可逆的损伤，造成菌体的直接死亡或在存放过程中死亡，因此当前乳杆菌制品通常采用添加冻干保护剂来减少乳杆菌菌体在冷冻干燥过程中所受损伤，提高其冻干存活率与存放的稳定性。冻干保护剂对乳杆菌的主要保护原理包括：(1)减少微生物冻结时乳杆菌菌体的细胞膜破裂、细胞脱水、细胞质浓缩等物理化学变化造成的损伤；(2)填充作用，保证冻干体系中的有效成分不飞散；(3)防止冻干前沉淀；(4)维持冻干体系ph值，氧含量等。

3、已经有较多的现有技术利用冻干保护剂制备微生物冻干制品，例如专利cn102649945a、cn113005040a和cn114376977a中所呈现的技术。cn102649945a和cn113005040a都通过研究保护剂的成分和含量提高菌的冻干存活率，特别是cn113005040a能使得冻干存活率达到80％-90％。cn114376977a则更侧重于研究活菌制剂在结肠的靶向释放。然而与冻干存活率同样重要的是常温储存的稳定性。市场中的产品很少有能够在常温下长期存储的冻干制品，常温条件下冻干制品中活菌存活率随着保存时间迅速下降。专利cn113005040a的常温存储已经达到了较高的水平，其1个月存活率为79％。然而3个月后迅速降低到65％以下。

4、因此，为了进一步提高乳杆菌冻干粉在常温条件下储存时活菌存活率，有必要找到适宜的冻干保护剂，以解决冻干粉常温放置稳定性差的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种冻干保护剂及含有其的混合液或乳杆菌冻干制品，有效解决乳杆菌冻干粉在常温条件下储存稳定性差的问题。

2、本发明的研究人员前期提供了一种冻干保护剂，以冻干保护剂的干重计，含有80-88％的二糖、0.1-1％的多糖、5-10％的氨基酸/蛋白和5-10％的抗氧化剂。该保护剂用作乳杆菌冻干保护时，冻干存活率高，而且能够有效提高常温存储稳定性，3个月、6个月常温存储存活率基本大于70％。

3、上述冻干保护剂在用于约氏乳杆菌和格氏乳杆菌冻干制品时，效果尤其令人惊喜，这两种乳杆菌冻干制品的3个月、6个月的常温存储存活率基本大于80％。虽然已证实前述配方的效果，然而针对商业化产品的活菌都努力实现常温存储存活率基本大于80％仍是需要的。

4、因而，本发明人基于前述方案已有的成果，进一步研究并提供了另一种能够使詹氏乳杆菌和卷曲乳杆菌的常温存储稳定性也能达到理想效果的冻干保护剂，以冻干保护剂的干重计，其含有50-60％的二糖、25-35％的第一氨基酸/蛋白、0.1-1％的多糖、5-10％的第二氨基酸/蛋白、5-10％的抗氧化剂，所述第一氨基酸/蛋白为l-精氨酸或其盐酸盐，所述第二氨基酸/蛋白为谷氨酸钠、酸水解酪蛋白、水解植物蛋白中的至少一种。

5、在一些实施方案中，所述二糖选自蔗糖、海藻糖的至少一种。

6、在一些实施方案中，所述50-60％的二糖包括35-60％的海藻糖和0-20％的蔗糖。

7、在一些实施方案中，所述5-10％的第二氨基酸/蛋白含有5-10％的谷氨酸钠。

8、在一些实施方案中，所述5-10％的第二氨基酸/蛋白含有5-7％的酸水解酪蛋白。

9、在一些实施方案中，所述第二氨基酸/蛋白为酸水解酪蛋白，根据研究结果，选用酸水解酪蛋白的保护剂其常温存储稳定性更高。在一些实施方案中，选用所述氨基酸/蛋白为谷氨酸钠，其成分单一，在药物制造中有一定优势。

10、在一些实施方案中，所述多糖选自普鲁兰糖、阿拉伯胶、黄原胶的至少一种。在一些实施方案中，所述多糖为黄原胶。

11、在一些实施方案中，所述抗氧化剂选自维生素c钠、谷胱甘肽、半胱氨酸盐酸盐的至少一种。在一些实施方案中，所述抗氧化剂为维生素c钠(vc钠)。

12、在一些实施方案中，提供一种冻干保护剂混合液，其含有上述冻干保护剂以及任意量的水，水用于将保护剂成分形成溶液或浆液或混悬液，以进一步与乳杆菌菌泥混合均匀。在一些实施方案中，保护剂与水的重量比为1：1-3，在一些实施方案中为1：1.5-2.5，在一些实施方案中为1：1.5-2.0。

13、可以理解的是，经过冻干工艺后残留的水量一般低于冻干制品重量的10％，优选低于7％，更优选低于5％，比如0.5-5％、0.5-3％。

14、本发明还提供了一种乳杆菌冻干制品，其含有前述任一方案所述的冻干保护剂和乳杆菌。

15、在一些实施方案中，上述乳杆菌冻干制品中含有的乳杆菌选自詹氏乳杆菌和/或卷曲乳杆菌。

16、在一些实施方案中，乳杆菌菌泥湿重与干的保护剂的重量比为1：0.5-1.5或1：0.8-1.2。

17、本发明还提供了上述乳杆菌冻干制品的制备方法：包括保护剂混合液的制备和冻干制品的制备步骤。这些步骤可以采用本领域常用的一些方法，例如cn102649945a、cn113005040a、cn104147605a等。本发明的实施例也提供了一些非限制性的实例。例如，保护剂混合液的制备包括先按上述重量份分取二糖、氨基酸/蛋白、抗氧化剂、多糖及纯化水，将二糖、多糖类加入纯化水中搅拌混合均匀，灭菌，得灭菌混合液，再将氨基酸/蛋白、抗氧化剂溶解于灭菌混合液，混合均匀制得乳杆菌冻干保护剂。所述灭菌可以是121℃高压蒸汽灭菌20-30min，或其他灭菌方式。冻干制品的制备步骤包括将乳杆菌菌泥与保护剂混合液混合均匀，再经冷冻干燥制备成乳杆菌冻干粉，所述乳杆菌冻干粉在常温条件下存储3个月、6个月其活菌存活率可达80％以上。

18、更具体的制备方法包括如下步骤：

19、s1收集菌泥：将乳杆菌经种子液培养、发酵培养后所得乳杆菌菌液，进行离心，收集菌泥，重悬于无菌pbs，离心，得到乳杆菌菌泥；

20、s2配置保护剂：配制乳杆菌保护剂混合液；

21、s3菌泥乳化：将乳杆菌菌泥与保护剂混合液混合均匀，得到乳杆菌菌悬液；

22、s4冷冻干燥：将乳杆菌菌悬液冷冻干燥、粉碎、过筛，得到乳杆菌冻干粉；所述冷冻干燥，其真空度为12～30pa，其升华干燥温度为-30℃～-10℃，其解析干燥温度为10～25℃。

23、在一些实施方案中，所述乳杆菌采用詹氏乳杆菌或卷曲乳杆菌。例如专利cn110656060a中的詹氏乳杆菌cctcc no.2019429、卷曲乳杆菌cctccno.2019427。

24、相比于现有技术，本发明的技术方案解决了乳杆菌冻干粉常温放置稳定性差的难题，提高了常温条件下储存乳杆菌冻干粉的活菌存活率，为常温储存、运输乳杆菌冻干粉提供了有利条件，降低储存、运输成本的同时，为更好和更广泛的应用乳杆菌冻干粉提供了新的途径。此外，本发明的一些技术方案还解决了工艺操作中的一些难题，使得放大生产成为可能。