S100A8和S100A9的抗体、异源二聚体、检测试剂盒及其用途的制作方法

本技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种结合s100a8或s100a9的抗体或其抗原结合片段、一种s100a8和s100a9的异源二聚体、一种试剂盒，还具体涉及所述抗体或其抗原结合片段、所述异源二聚体、所述试剂盒的用途。

背景技术：

1、s100蛋白家族是一类低分子量的钙结合蛋白，以同源或异源二聚体的形式存在，以维持蛋白稳定性，可通过ca2+的调节及与靶蛋白相互作用发挥多种生物学功能。其中，s100a8由93个氨基酸残基组成，s100a9由113个氨基酸组成。

2、基于s100a8及s100a9表面疏水基团的分布特性，二者更容易形成异源二聚体，且异源二聚体的稳定性远大于同源二聚体。s100a8和s100a9的异源二聚体(下面简称为s100a8/s100a9异源二聚体)从中性粒细胞释放后，主要通过与两种模式的识别受体结合来发挥其效应功能：toll样受体4(tlr4)和晚期糖基化终末产物受体(rage)。作为炎症反应的危险信号，s100a8/s100a9参与多种炎症和免疫反应的调节，被认为是炎症标志物和潜在的治疗靶标。在感染和非感染性炎症，包括脓毒症、系统性红斑狼疮、慢阻肺及肿瘤等多种疾病状态下均观察到了s100a8/s100a9的显著升高。近期我们发表于心血管领域权威期刊circulation的工作及后续国际多个团队的工作均证实了(circulation,2019,140(9):751-764)：s100a8/s100a9在心肌缺血/再灌注损伤早期快速升高，s100a9中和抗体治疗能明显减缓心肌缺血/再灌注损伤；并证实了s100a8/s100a9在急性心肌梗死介入治疗术后早期预警的重要预测价值。

3、但是，目前没有能够仅对s100a8/s100a9异源二聚体进行特异性检测的试剂盒。因此，建立一种新型试剂盒来检测临床样本中的s100a8/s100a9异源二聚体水平，作为系统性炎症反应的早期预警方法，具有重要临床及科研价值。

4、同时，研发针对s100a8和s100a9的抗体需要高纯度的蛋白作为抗原，且检测试剂盒中也需要高纯度的s100a8/s100a9异源二聚体蛋白作为标准品。然而，s100a8和s100a9自身均容易形成同源二聚体甚至高聚体(如四聚体)蛋白产物，导致体外表达时异源二聚体难以形成、或形成量大大降低，难以获得高纯度、高质量的异源二聚体。因此，亟需利用基因工程等手段对s100a8/s100a9异源二聚体进行高纯度的体外表达，以帮助建立s100a8/s100a9异源二聚体的高特异性检测试剂盒，并有助于进一步对该二聚体的结构和生物学功能进行深入研究。

5、需要注意的是，在此部分中描述的方法不一定是之前已经设想到或采用的方法。除非另有指明，否则不应假定此部分中描述的任何方法仅因其包括在此部分中就被认为是现有技术。类似地，除非另有指明，否则此部分中提及的问题不应认为在任何现有技术中已被公认。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本技术提供了一种结合s100a8或s100a9的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗体或抗原结合片段至少包含选自下述组(i)-(iii)和/或组(iv)-(v)的组中的一组或多组：(i)seq id nos:1、2、3、4、6所示序列和ras；(ii)seq idnos:7、8、9、10、12所示序列和eas；(iii)seq id nos:13、14、15、16、18所示序列和ras；(iv)seq id nos:19、20、21、22、24所示序列和aas；和/或(v)seq id nos:25、26、27、28、30所示序列和sas。

2、根据本技术的一种实施方式，还提供了一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码本技术所述的抗体或其抗原结合片段。

3、根据本技术的一种实施方式，还提供了一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含本技术所述的多核苷酸。

4、根据本技术的一种实施方式，还提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含本技术所述的多核苷酸、和/或本技术所述的重组载体。

5、根据本技术的一种实施方式，还提供了一种多肽，其特征在于，所述多肽包含与seq id no:61、seq id no:65、seq id no:63、或seq id no:67中任一项所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的氨基酸序列。在一些优选的实施方式中，所述多肽包含seq id no:61、seq id no:65、seq id no:63、或seq id no:67中任一项所示序列。通过将人s100a9蛋白a链第9位亲水氨基酸e突变为疏水氨基酸a，有效降低了s100a9形成同源二聚体和高聚体，从而有利于获得高纯度的s100a9蛋白。

6、根据本技术的一种实施方式，还提供了一种s100a8和s100a9的异源二聚体，其特征在于，所述异源二聚体包含与seq id no:61和seq id no:67所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的氨基酸序列。在一些优选的实施方式中，所述异源二聚体包含seq id no:61和seq id no:67所示序列。通过将人s100a9蛋白a链第9位氨基酸e突变为氨基酸a，并将该突变型s100a9与野生型s100a8共表达，可以有效减少同源二聚体的产生，获得高纯度的可溶性异源二聚体；同时，这些突变不会影响蛋白的活性，所得重组蛋白活性较好。

7、本技术提供的高纯度s100a8蛋白、s100a9蛋白、s100a8/s100a9异源二聚体，为研究这些蛋白的功能奠定了基础，且纯化所得高纯度蛋白可作为标准品用于检测试剂盒中、或作为抗原用于开发特异性的抗体，具有较好的应用前景。

8、根据本技术的一种实施方式，还提供了一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码本技术所述的多肽、或编码本技术所述的异源二聚体。

9、根据本技术的一种实施方式，还提供了一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含本技术所述的多核苷酸。

10、根据本技术的一种实施方式，还提供了一种编码本技术所述的异源二聚体的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括s100a8融合基因和s100a9融合基因；所述s100a8融合基因包括可操作连接的第一启动子和s100a8基因，所述s100a8基因的核酸序列如seq idno：62所示；所述s100a9融合基因包括可操作连接的第二启动子和s100a9基因，所述s100a9基因的核酸序列如seq id no：68所示。本技术提供的表达载体导入宿主细胞后，可以在宿主细胞内形成活性异源二聚体，并可通过纯化获取大量高活性、高纯度的s100a8/s100a9异源二聚体，表达量可达到10mg/l，纯度可达90％以上。在一些实施方式中，所述第一启动子和所述第二启动子相同。通过在一个载体中用2个启动子分别驱动s100a8基因和s100a9基因的表达，可实现s100a8基因和s100a9基因的共表达；并且，选用转录能力相同或相近的启动子可使2个基因的表达水平比较平衡，有利于促进异源二聚体的产生。

11、根据本技术的一种实施方式，还提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含本技术所述的多核苷酸、和/或本技术所述的表达载体。

12、根据本技术的一种实施方式，还提供了一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括本技术所述的抗体或其抗原结合片段、本技术所述的多肽、和/或本技术所述的异源二聚体。在一些实施方式中，所述试剂盒包括捕获抗体和标记抗体。本技术提供的s100a8/s100a9异源二聚体检测试剂盒，其中的标准品为本技术提供的s100a8/s100a9异源二聚体，同时采用了抗体配对策略，即捕获抗体为s100a8抗体、标记抗体为s100a9抗体，或者捕获抗体为s100a9抗体、标记抗体为s100a8抗体，具有灵敏度高、特异性强、操作简单的特点。

13、根据本技术的一种实施方式，还提供了本技术所述的抗体或其抗原结合片段、和/或本技术所述的多肽在制备用于检测s100a8、s100a9、s100a8和s100a9的二聚体的试剂、试剂盒、抗体芯片或抗体探针中的用途。

14、根据本技术的一种实施方式，还提供了本技术所述的异源二聚体在制备用于检测s100a8和s100a9的二聚体的试剂、试剂盒中的用途。

15、根据本技术的一种实施方式，还提供了本技术所述的抗体或其抗原结合片段、本技术所述的多肽、和/或本技术所述的异源二聚体在制备用于检测疾病或非疾病症状的试剂、试剂盒、抗体芯片或抗体探针中的用途。

16、根据本技术的一种实施方式，还提供了一种非疾病症状的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：获取受试者样品；使用本技术所述的抗体或其抗原结合片段、本技术所述的多肽、本技术所述的异源二聚体、和/或本技术所述的试剂盒，检测所述样品中s100a8和s100a9的二聚体的表达水平；和根据所述样品中s100a8和s100a9的二聚体的表达水平判断所述受试者具有所述非疾病症状。

17、应当理解，本部分所描述的内容并非旨在标识本技术的实施例的关键或重要特征，也不用于限制本技术的范围。本技术的其它特征将通过以下的说明书而变得容易理解。