利用腺嘌呤碱基编辑器制备gE、gI和TK三基因缺失PRV毒株的方法与应用

本发明涉及生物，具体讲是利用腺嘌呤碱基编辑器制备ge、gi和tk三基因缺失prv毒株的方法与应用。

背景技术：

1、猪伪狂犬病是一种高度接触性、败血性及烈性传染病，各年龄段的猪均易感，妊娠母猪感染后可引发流产、死胎、木乃伊胎或产弱胎；仔猪感染后可引起高热、神经症状及呼吸困难，新生仔猪感染后多表现为神经症状，死亡率约100％；种猪感染后则造成种猪不育，母猪不发情，配种困难，公猪睾丸肿胀萎缩，丧失种用能力。该病病原体是伪狂犬病病毒(prv)，该病毒为双股dna病毒，只有一个血清型，是疱疹病毒目、疱疹病毒科、a-疱疹病毒亚科、水痘病毒属成员，基因组全长约150kb，平均g+c含量高达74％，具有典型的疱疹病毒基因组结构特征，由独特长区段ul、独特短区段us及位于两侧的末端重复序列(tr)和内部重复序列(ir)组成。研究发现能够该病毒能感染家猪、野猪、牛、羊、兔、小鼠、犬、猫、浣熊等多种家养及野生动物，猪是是本病重要传染源，且是唯一能够在病毒感染后存活的动物。我国自1947年刘永纯首次在猫体中发现伪狂犬病，80年代后随着集约化养殖业的兴起，pr发生的病例逐年增多并呈现上升趋势。barbara等首先推导出了整个prv基因组的基因结构。研究发现ge、gi为该病毒的糖蛋白，同时是主要毒力基因，后续有研究表明ge和gi形成的复合体能促进病毒释放和由细胞到细胞的转运，但却不是病毒增殖所必需的。tk基因也是最主要的毒力基因之一，对prv在体内神经细胞中的增殖及潜伏感染的建立发挥关键作用，然而tk属于非必需基因。缺失tk基因的prv无法在神经细胞中复制，可降低prv的致病性，却不影响病毒的免疫原性，是研发安全有效的prv弱毒疫苗的重要方案之一。因此沉默这三个毒力基因，不仅可以降低病毒的毒性，还能不影响免疫原性。

2、早期的基因编辑主要利用dna同源重组原理，主要技术主有zfns、talens，但因其设计复杂、敲除效率低、脱靶严重、成本高、可操作性差等一系列缺点，发展受到了限制。crispr/cas9系统自2012年发现以来由于其高效、方便和应用范围广等特点，成为最受欢迎的基因改造工具。研究人员将crispr/cas9应用于果蝇，线虫，植物，鼠，兔，猪，甚至是非人灵长类动物，不仅实现了基因的成功敲除，还通过提供外源供体dna模板的方式实现了外源片段的成功敲入。

3、2015年，中山大学黄军就团队首次将crispr/cas9编辑系统用于人类胚胎，在胚胎水平证实了crispr/cas9在人类胚胎编辑的可行性，也证实了其用于β地中海贫血治疗的有效性。然而和zfns、talens一样，crispr/cas9实现基因编辑依赖于dsbs的产生，这就不可避免地触发nhej修复方式，引起随机的插入缺失突变，从而造成较高频率的非预期的碱基突变或脱靶切割。为了克服这一技术难关，研究者们进行了很多探索，其中单碱基编辑技术的出现为实现精确高效的碱基替代带来了希望。

4、单碱基编辑技术对crispr/cas9系统中的cas蛋白进行改造，使其失去核酸酶切割活性或仅能切割单链产生缺口，碱基编辑技术基于碱基脱氨原理(a→i、g→u)，将改造后cas9蛋白和脱氨酶进行融合，依靠sgrna将碱基编辑酶锚定到靶位点，通过dna的复制和修复，实现了不需要引入dna双链断裂就可进行单碱基转换的精确编辑，提高了碱基编辑的精确度和效率。gaudelli等把escherichia coli来源的trna腺苷酸脱氨酶(tada)与ncas9融合，经过多轮筛选和蛋白修饰后，开发出可以将腺嘌呤精准地转化成鸟嘌呤的新型单碱基转化系统(adenine base editor，abe)，且随着生物技术的发展，形成了更多高效特异的单碱基替换系统。abe系统经过7轮改造，筛选到效率较高的abe版本abe7.10，其有效编辑窗口在sgrna的第4-7位。

5、abe的应用受到脱氧腺苷脱氨酶与spcas9以外cas同系物的有限兼容性限制，richter等使用噬菌体辅助的非连续和连续进化，基于crispr/cas9系统开发的单碱基替换系统be3和abe7.10，继续改进abe7.10的脱氨酶组分，从而产生了目前编辑效率较高的abe版本：abe8e。与abe7.10相比，abe8e包含8个额外的突变，可将活性提高590倍，且与各种cas9或cas12同源物配对时，可以大大提高编辑效率。自abe工具被开发后，jin-soo kim课题组率先将其应用于小鼠疾病模型构建和遗传疾病的纠正。随后，中国科学院神经科学研究所刘真课题组的实验结果进一步证实了abe7.10对临床治疗的意义。目前已有多个研究证实单碱基编辑器可在多个物种中进行高效率工作，如细菌、植物及哺乳动物。但目前在伪狂犬病毒上的应用未见报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供利用腺嘌呤碱基编辑器制备ge、gi和tk三基因缺失prv毒株的方法与应用。

2、本发明的技术解决方案如下：

3、一种ge、gi和tk三基因缺失prv毒株，于2023年6月30日，保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学，保藏编号cctcc no：v202325，命名为：猪伪狂犬病毒prv-δtk/δgi/δge-abe；其ge基因序列如seq id no.8所示，gi基因序列如seq id no.9所示，tk基因序列如seq id no.10所示。

4、利用腺嘌呤碱基编辑器制备ge、gi和tk三基因缺失prv毒株的方法，包括以下步骤：

5、s1：构建sgrna骨架质粒；

6、选择prv病毒中ge、gi、tk基因的起始密码子作为靶标位点，利用腺嘌呤碱基编辑器设计七条sgrna序列，根据sgrna序列分别合成单链寡核苷酸，将单链寡核苷酸退火获得带粘性末端的双链dna片段，将pu6-sgrna-puro-2a-egfp载体经限制性内切酶酶切后回收片段，再与上述带粘性末端的双链dna片段连接，获得连接产物，即sgrna表达载体；

7、将连接产物转化至感受态细胞中，涂板筛选培养，挑阳性菌扩大培养，对阳性菌液抽提质粒；

8、s2：质粒转染；

9、将质粒转染至vero81细胞中，转染后，吸取病毒液，离心收集上清液。

10、作为本发明的优选方法，所述七条sgrna序列分别如seq id no.1，seq id no.2，seq id no.3，seq id no.4，seq id no.5，seq id no.6，seq id no.7所示。

11、作为本发明的优选方法，所述限制性内切酶采用bbsⅰ酶。

12、作为本发明的优选方法，所述合成单链寡核苷酸的序列如下：

13、ng-abe8e-tk-1m-f：caccgtgcgcatcccggcgcgcttc

14、ng-abe8e-tk-1m-r：aaacgaagcgcgccgggatgcgcac

15、ng-abe8e-tk-2m-f：caccggtgatggcgctcggcgggg

16、ng-abe8e-tk-2m-r：aaacccccgccgagcgccatcacc

17、ng-abe8e-tk-3m-f：caccgtacgccatcggctcgggca

18、ng-abe8e-tk-3m-r：aaactgcccgagccgatggcgtac

19、ng-abe8e-gi-1m-f：caccgcatcatcgacgccggtactg

20、ng-abe8e-gi-1m-r：aaaccagtaccggcgtcgatgatgc

21、ng-abe8e-gi-2m-f：caccgatgatgatggtggcgcgcga

22、ng-abe8e-gi-2m-r：aaactcgcgcgccaccatcatcatc

23、ng-abe8e-gi-3m-f：caccggatgatggtggcgcgcgacg

24、ng-abe8e-gi-3m-r：aaaccgtcgcgcgccaccatcatc

25、ng-abe8e-ge-f：caccggccgcatggtctcaacccc

26、ng-abe8e-ge-r：aaacggggttgagaccatgcggcc。

27、作为本发明的优选方法，所述ng-abe8e为表达ncas9蛋白的质粒。

28、作为本发明的优选方法，所述转染前，将vero81细胞在含有胎牛血清的培养液中进行培养，培养至对数生长期。

29、本发明还公开了一种ge、gi和tk三基因缺失的prv毒株，采用如上任一所述的构建方法制得。

30、本发明公开了一种如上所述的ge、gi和tk三基因缺失的prv毒株在制备伪狂犬疫苗上的应用。

31、本发明的有益效果是：本发明的方法效率高，对病毒基因的改变小，不容易引起病毒的变异，成本低。