一种SLC7A7转运蛋白促进精氨酸改善猪肠道应激方法

本发明涉及生物，具体是一种slc7a7转运蛋白促进精氨酸改善猪肠道应激方法。

背景技术：

1、畜牧业集约化程度的不断增加，生产者获得了较高的经济效益和生产效率。然而这种高密度生产，也会导致母猪和仔猪发生应激，从而影响生产性能。仔猪阶段，由于身体发育不成熟，更容易受到各种因素的影响，从而产生应激，包括断奶、极端温度、运输以及高密度等，造成机体适应能力的破坏最终引发疾病。

2、精氨酸是哺乳动物细胞中蛋白质合成和信号转导中重要的必需氨基酸。与许多氨基酸一样，精氨酸可以从膳食中吸收，也可以由谷氨酸生物合成，这取决于动物体的营养状况。在前人的研究中，精氨酸已经被确定在维持动物机体的健康中发挥关键作用，包括免疫应答、伤口愈合、生长激素释放以及细胞增殖等。

3、新生仔猪容易遭受冷、热、缺水、饥饿，拥挤等现象，导致机体自身营养消耗增加，产生应激和疾病。仔猪胃肠道发育不完全，免疫系统功能不健全，极易受到病原体感染，导致腹泻，不进食甚至死亡。肠道作为机体最大的免疫器官，对减少和防止仔猪的低生产性能、发病率和肠道易感性至关重要。仔猪在受到应激或者机体损伤时，小肠的形态变化表现为绒毛高度降低和隐窝深度增加，导致吸收细胞数量减少，分泌细胞数量增加。这也与饲料摄入量减少，营养吸收和免疫力降低有关。病原入侵时，免疫系统被激活，活化的免疫细胞主动重塑细胞内的微生物及其代谢以满足其功能变化的需要。氨基酸代谢在这种代谢编程中起着关键作用，它支持各种细胞的增殖、抗氧化和抗炎等功能。可见，研究氨基酸代谢对动物肠道及机体健康的调控有助于通过营养策略提高仔猪对病原体入侵的抵抗能力。

技术实现思路

1、本发明通过构建大白猪和马身猪仔猪饥饿应激模型，利用整合组学(微生物组、代谢组和转录组)多层次、多角度解析仔猪饥饿应激后肠道微生态调控机制产生差异的原因。通过构建猪肠上皮细胞和大鼠饥饿应激模型探析l-精氨酸通过增强饥饿应激后肠道氨基酸转运和代谢来维持肠道稳态，提示与大白猪仔猪相比，氨基酸的转运、代谢合成能力增强可能是马身猪仔猪在饥饿应激后肠道屏障较完整的原因之一，为仔猪肠道健康调控及地方品种保种利用提供理论基础。

2、本发明所采用的技术方案为：一种slc7a7转运蛋白促进精氨酸改善猪肠道应激方法，包括具体的步骤如下：

3、s1：以大白猪和马身猪为研究对象，在相同饲养管理条件下，同品种中选择日龄相同的断奶阉割公猪各9头，设立对照组，饥饿48h应激组和饥饿72h应激组，每组3个重复；通过血液指标、肠道结构变化评价仔猪饥饿应激程度；通过16s rrna测序、lc-ms测序和rna-seq技术对仔猪肠道微生物、代谢产物和基因表达变化进行整合组学分析，构建饥饿应激仔猪肠道微生态的调控网络；

4、具体研究方案包括：

5、仔猪饥饿应激后肠道微生态调控网络：肠道微生态对于机体营养物质吸收代谢、免疫疫屏障形成具有非常重要的作用，一方面肠道黏膜组织与微生物产生信号传导，促进有益微生物的定殖，形成微生物防疫屏障，另一方面菌群将大分子营养物质代谢成为小分子产物促进机体吸收，同时微生物分泌的抗原物质刺激肠道组织产生抗体进而促进黏膜免疫屏障形成。本研究基于差异菌属、差异代谢产物以及组织degs信息，进行相关性分析，构建肠道微生态相作网络；

6、饥饿应激诱导仔猪肠道氨基酸代谢紊乱：为了验证饥饿应激诱导仔猪的肠道氨基酸代谢紊乱，采用qrt-pcr和elisa技术检测大白猪和马身猪仔猪饥饿应激模型中回肠组织相关基因的表达变化。

7、s2：构建猪肠上皮细胞(ipec-j2)饥饿应激模型，分析l-精氨酸(l-arginine，l-arg)缓解二氟甲基鸟氨酸(dfmo)引起的ipec-j2细胞应激损伤的作用机制；

8、具体研究方案包括：

9、dfmo诱导ipec-j2细胞凋亡；l-精氨酸缓解dfmo诱导ipec-j2细胞损伤；l-精氨酸缓解dfmo诱导ipec-j2细胞氨基酸代谢紊乱；

10、s3：开展预饲l-arg断奶大鼠饥饿应激试验，分析预饲l-arg对大鼠饥饿应激后肠道稳态的保护作用；

11、具体研究方案包括：

12、预饲l-精氨酸对饥饿应激模型大鼠体重和血液指标的影响；l-精氨酸减弱饥饿应激诱导的大鼠肠道屏障损伤；l-精氨酸减弱饥饿应激诱导的大鼠肠道氨基酸代谢紊乱。

13、作为本发明进一步的方案：所述仔猪饥饿应激后肠道微生态调控网络具体实验为：大白猪仔猪构建的网络中包含12个菌属、18个代谢产物和16个基因，共46个节点和115条边；l-赖氨酸、l-组氨酸和精胺是互作网络中连通度较多的三个代谢产物，最多与11个节点相连；l-赖氨酸和l-组氨酸具有相似的调控网络，与乳杆菌属以及代谢(slc7a7、pla2g12b)和免疫(cyp3a29)相关基因显著正相关，与埃希氏-志贺氏菌属显著负相关；精胺与乳酸杆菌和ntf3显著正相关，与罗姆布茨菌属和免疫相关基因(cyp3a29)显著负相关；其次是油酸、l-苯丙氨酸、癸酰肉碱等与其他分子之间高度相关，油酸和吲哚与氨基酸代谢相关基因(slc7a7、nags和sephs2)的表达显著负相关，l-苯丙氨酸则相反；此外，癸酰肉碱与多种有益菌属(乳杆菌属、韦荣氏球菌属、链球菌属和乳球菌属)的丰度变化显著正相关，与免疫相关的基因(cd28和lat)显著负相关；值得关注的是，slc7a7和nags分别7种不同的代谢产物显著相关，pla2g12b与6种代谢产物显著相关，最高相关性为0.8984。

14、马身猪仔猪调控网络中包含10个菌属、18个代谢产物和16个基因，共44个节点和85条边；代谢产物中油酸和l-天冬氨酸连通度最高，分别有14和13条边，均与埃希氏-志贺氏菌属、smb53和代谢(apoe)以及调节免疫(cxcl6和hla-drb1)相关基因显著负相关；癸酰肉碱与菌属和基因有10条边相连，与紧密连接蛋白(cldn7)和有益菌(乳杆菌属和瘤胃球菌属)显著负相关，与调控免疫(cxcl6和hla-drb1)基因显著正相关；同时发现l-精氨酸和亚精胺与slc7a7的表达显著负相关，l-谷氨酰胺与slc7a7的表达显著正相关。此外，pla2g2b、hla-c和cd28分别与多个代谢产物的连通度较高，最高达到8条边；其中hla-c和cd28与肌酸、吲哚和l-组氨酸显著正相关，但pla2g2b与之正相反。

15、作为本发明进一步的方案：所述饥饿应激诱导仔猪肠道氨基酸代谢紊乱的具体实验结果为：大白猪仔猪饥饿应激试验结果表明随着饥饿时间增加slc7a7、arg1和odc1的表达持续降低(p<0.01)，slc7a6、slc7a1持续升高(p<0.01)；而在马身猪仔猪长期饥饿应激(72h)后肠道大部分与氨基酸转运和代谢相关基因(slc7a7、slc7a6、slc7a2、arg1)的表达极显著升高(p<0.01)，在短期饥饿应激(48h)后odc1的表达量最高，长期饥饿应激后极显著降低但相对表达量仍高于大白猪仔猪(p<0.01)；elisa试验结果表明大白猪仔猪肠道多胺的浓度在长期应激后显著降低，而在马身猪仔猪中无显著差异；以上结果表明，与大白猪仔猪相比，马身猪仔猪在饥饿应激后有更强的氨基酸转运和代谢能力，产生更多的多胺维持肠道稳态。

16、作为本发明进一步的方案：所述s2中的具体细胞机制实验如下：

17、s1：dfmo诱导ipec-j2细胞凋亡

18、通过dfmo消耗细胞培养基中的多胺建立肠道细胞饥饿模型；采用cck-8试验检测dfmo对ipec-j2细胞增殖的影响；dfmo诱导ipec-j2细胞活力降低呈时间和浓度依赖性增加，1mm和2mm dfmo能够极显著降低细胞活力(p<0.01)；根据试验结果，为了减少细胞损伤，选择1mm dfmo的浓度进行后续试验；edu试验结果表明，与对照组相比，添加1mm dfmo能够显著降低增殖期的细胞数量，这与cck-8的结果一致；elisa试验结果发现添加1mm dfmo显著降低细胞中多胺的表达，表明ipec-j2细胞饥饿模型构建成功；

19、为了进一步确定dfmo对ipec-j2细胞的损伤程度，采用qrt-pcr检测与细胞增殖、凋亡以及紧密连接蛋白相关基因的表达；试验结果表明，与对照组相比，dfmo处理后与细胞增殖相关基因(pcna、cdk2和mki-67，p<0.01；bcl2，p<0.05)的表达显著降低；与细胞凋亡相关基因(p53和caspase-3，p<0.01；caspase-9，p<0.05)的表达显著增加；与细胞紧密连接相关基因(zo-1和occludin，p<0.01；claudin-1，p<0.05)的表达极显著降低；以上结果表明，dfmo能够诱导ipec-j2细胞凋亡和紧密连接损伤；

20、s2：l-精氨酸缓解dfmo诱导ipec-j2细胞损伤

21、通过测定细胞活力评估l-精氨酸对ipec-j2细胞生长的影响，试验结果表明，在细胞中添加l-精氨酸培养24h后，细胞活力极显著增加(p<0.01)，且在添加1mm l-精氨酸时细胞活力达到最高；采用1mm dfmo诱导细胞，同时添加1mm和2mm l-精氨酸后能够极显著缓解dfmo对ipec-j2细胞活力的抑制作用；tunel试验结果表明，添加1mm和2mm l-精氨酸能够缓解dfmo诱导的细胞凋亡，这与cck-8的试验结果一致；

22、采用qrt-pcr和western blot方法检测增殖、凋亡和紧密连接相关基因和蛋白，分析l-精氨酸在dfmo诱导的ipec-j2细胞中抗损伤的可能机制。添加l-精氨酸后极显著提高了dfmo诱导后增殖标志物(cdk2、bcl2和pcna)和紧密连接相关基因(occludin、zo-1和claudin-1)的表达(p<0.01)；相反，添加l-精氨酸后显著降低了凋亡相关基因(caspase-9、caspase-3和p53)的表达；western blot分析显示，与基因表达结果类似，添加dfmo极显著降低cdk2和claudin-1蛋白水平(p<0.01)，显著降低pcna和occludin蛋白水平(p<0.05)，极显著增加了caspase-3蛋白水平(p<0.01)，但p-p53蛋白表达无显著差异(p>0.05)；在此基础上添加1mm l-精氨酸处理可显著逆转dfmo诱导的ipec-j2细胞增殖、凋亡和紧密连接损伤；

23、s3：l-精氨酸缓解dfmo诱导ipec-j2细胞氨基酸代谢紊乱

24、根据上述分析表明马身猪仔猪饥饿应激后，l-精氨酸代谢合成相关代谢产物的浓度以及氨基酸转运蛋白的表达显著高于大白猪仔猪；为了分析l-精氨酸在细胞应激模型中缓解氨基酸代谢紊乱的作用机制，采用qrt-pcr和western blot检测大鼠回肠中氨基酸转运、代谢相关基因和蛋白的表达；结果发现，dfmo处理后极显著降低氨基酸转运蛋白(slc7a7，p<0.01；slc7a6，p<0.05)和精氨酸代谢合成相关基因(odc1，p<0.01；arg1，p<0.05)的表达；当添加l-精氨酸后能够显著增加氨基酸转运蛋白(slc7a7、slc7a1、slc7a2，p<0.01)和精氨酸代谢合成相关基因(arg1和odc1，p<0.01；arg2，p<0.05)的表达；westernblot试验分析表明，dfmo诱导的细胞应激显著降低odc1以及slc7a7蛋白的表达(p<0.05)，但对arg1蛋白的表达没有显著影响(p>0.05)，添加l-精氨酸后极显著增加odc1和slc7a7蛋白的表达(p<0.01)；elisa试验结果表明，添加l-精氨酸减弱dfmo诱导的ipec-j2细胞多胺的下调(p<0.01)；以上结果表明l-精氨酸通过提高氨基酸转运蛋白、精氨酸代谢合成酶以及产物缓解dfmo诱导的细胞应激反应。

25、作为本发明进一步的方案：所述s3中的大鼠饥饿应激试验如下：

26、s1：预饲l-精氨酸对饥饿应激模型大鼠体重和血液指标的影响

27、本试验对3-4周龄的大鼠预饲l-精氨酸2周后饥饿48h，构建大鼠饥饿应激模型。各组初始体重没有差异，饲喂两周后各组大鼠体重极显著高于2周前(p<0.01)，但0.1％和0.2％l-精氨酸饲喂与正常饲料组无显著差异。由于饥饿48h的短期作用，饥饿应激组以及预饲l-精氨酸后应激组体重略有下降，但与饥饿前没有显著差异。

28、通过酶联免疫吸附试验(elisa)对饥饿应激模型大鼠血清中与代谢、应激以及免疫相关的因子进行检测。与对照组相比，饲喂高低浓度精氨酸后极显著增加大鼠血清中tc、iga和ins的浓度，极显著降低glu的浓度(p<0.01)；饲喂低浓度的精氨酸显著降低cortisol的浓度(p<0.05)。饥饿应激后tc、tg、glu和iga的浓度极显著降低(p<0.01)，cortisol的浓度显著增加(p<0.05)。预饲低浓度的精氨酸通过极显著增加tc和tg的浓度，降低cortisol的浓度缓解饥饿造成的代谢紊乱和应激反应(p<0.01)，同时高低浓度的精氨酸能够通过极显著增加iga和ins的浓度增强大鼠的营养代谢和免疫水平(p<0.01)。

29、s2：l-精氨酸减弱饥饿应激诱导的大鼠肠道屏障损伤

30、通过he染色评估大鼠肠道形态的变化，与对照组相比，饥饿应激后大鼠小肠肠道绒毛肿胀、破碎，预饲精氨酸后大鼠肠道绒毛的完整性明显改善；根据统计分析表明，饥饿应激后大鼠小肠肠道绒毛的高度和绒隐比极显著降低，隐窝的深度极显著升高(p<0.01)，而通过预饲精氨酸后极显著增加绒毛的高度和绒隐比、降低隐窝深度(p<0.01)，维持大鼠肠道屏障的完整性。

31、此外，本试验通过检测大鼠肠道细胞紧密连接相关基因和蛋白的表达来反映肠道屏障的损伤程度；qrt-pcr试验结果表明，饥饿48h后大鼠肠道紧密连接相关基因(zo-1、occludin和claudin-1)的表达量极显著降低(p<0.01)，而预饲精氨酸显著增加紧密连接相关基因的表达(p<0.05)，且极显著缓解了饥饿应激引起的与紧密连接相关基因表达的下调(p<0.01；westernblot结果显示，饥饿应激后大鼠肠道occludin和claudin-1表达极显著降低(p<0.01)；然而，预饲高浓度精氨酸(2％l-arg)显著增加紧密连接蛋白(claudin-1，p<0.01；occludin，p<0.05)蛋白的表达，同时预饲精氨酸显著抑制饥饿应激诱导的紧密连接蛋白的下调；以上结果表明，l-精氨酸预饲减弱饥饿应激诱导的大鼠肠道结构和紧密连接损伤。

32、s3：l-精氨酸减弱饥饿应激诱导的大鼠肠道氨基酸代谢紊乱

33、由于应激引起的氨基酸转运蛋白和脱羧酶的下调导致精氨酸代谢合成紊乱，前期的测序和试验结果也证明了仔猪在饥饿应激后会导致氨基酸代谢失调；本试验利用qrt-pcr、elisa和western blot解析预饲l-精氨酸能否缓解由于饥饿应激引起的氨基酸代谢失调；与对照组相比，饥饿应激后大鼠肠道氨基酸转运和代谢合成相关基因(slc7a7、arg1和odc1，p<0.01；arg2，p<0.05)的表达显著降低；预饲精氨酸显著增加slc7a7、slc7a6和arg2的表达(p<0.01)，低浓度的精氨酸能够显著增加arg1的表达(p<0.05)，odc1的表达无显著差异(p>0.05)；同时发现预饲精氨酸显著增加饥饿应激模型大鼠肠道slc7a7、arg1和odc1的表达(p<0.01)；elisa试验结果表明预饲精氨酸缓解饥饿应激诱导的大鼠肠道多胺的下调；westernblot结果表明，饥饿应激导致大鼠肠道slc7a7和odc1的蛋白表达极显著降低(p<0.01)，arg1有降低的趋势但不显著(p>0.05)，预饲精氨酸能逆转这一现象，增强肠道氨基酸代谢合成能力。

34、本发明的有益效果：

35、本发明根据各阶段degs的功能进行分析，发现中国地方品种和国外品种仔猪对饥饿应激反应存在显著差异。在短期应激(饥饿48h)后，大白猪仔猪代谢水平提高，而马身猪仔猪激活了免疫应答。长期应激(饥饿72h)后，大白猪仔猪肠道组织严重脱落，免疫应答发生异常，而此时马身猪仔猪的脂质和氨基酸代谢水平显著提高。此外，对仔猪饥饿应激模型进行验证发现马身猪仔猪的精氨酸代谢合成能力显著高于大白猪仔猪。综上，本发明通过多组学联合分析从肠道微生态角度解析了马身猪抗逆性强的调控网络，为我国地方品种种质特性发掘与利用提供了重要的理论参考。

36、本发明通过构建ipec-j2细胞和无菌sd大鼠饥饿应激模型，从细胞和动物活体水平验证了l-精氨酸对肠道和黏膜组织的保护作用。l-精氨酸能够促进细胞增殖和细胞间的紧密连接，通过增加slc7a7、arg1、odc1分子等的表达提高肠道氨基酸转运和代谢合成能力，缓解应激对肠道组织的损伤，维持肠道稳态。