改善皮肤活性的活性肽及其在药品或化妆品中的应用的制作方法

本技术涉及生物领域，更具体的，涉及一种改善皮肤活性的活性肽及其在药品或化妆品中的应用。

背景技术：

1、肤是构成人体最外层的组织，它由表皮、真皮和皮下组织构成。表皮是皮肤的最外层，主要由角质形成细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞和默克尔细胞组成。角质形成细胞是表皮中发现的最丰富的细胞，起到抵御外界环境的屏障作用[5]。真皮包括弹性蛋白、胶原蛋白和葡萄糖胺聚糖(glucosaminoglycan)三个结构，是维持皮肤结构的细胞外基质(extracellular matrix)。皮肤老化表现为毛细血管扩张、色素沉着、面色蜡黄、干燥、松弛和深皱纹。根据作用机制的不同可分为内在老化和外在老化。内在老化是生物体随时间的一种潜伏的退化过程，与遗传易感性和生理成分有关，是人体生理变化的必然结果。外在老化是外源性环境下损伤的结果，例如紫外辐射(uv)、环境污染和化学品等。在几种外部刺激因素中，致皮肤老化最严重的是紫外辐射，根据光子波长的不同，uv辐射分为长波紫外线uva(320～400nm)、中波紫外线uvb(280～320nm)和短波紫外线uvc(200～280nm)。uvb可穿透表皮，直接导致dna突变。uva可深入真皮，诱导产生基质金属蛋白酶(mmps)分解胶原和弹性蛋白纤维，导致皮肤老化和皱纹形成。皮肤暴露在紫外线辐射下会引起各种生理效应，如晒伤、免疫抑制、光老化、皮肤色素沉着、突变、dna和蛋白质变性、癌症，以及活性氧(ros)的产生。

2、皱纹是皮肤老化的典型症状，由弹性丧失引起，弹性丧失与皮肤真皮组织弹性相关的胶原蛋白和弹性蛋白减少有关。胶原蛋白约占人类真皮细胞外基质(ecm)的90％，i型胶原蛋白是皮肤和结缔组织中最丰富的结构蛋白，占总胶原蛋白的80％，其结构变化被认为是皮肤老化和皱纹形成的主要原因。暴露于急性紫外辐射下的皮肤，活性氧(ros)和基质金属蛋白酶(mmps)会被上调，核因子-κb(nf-κb)也被激活。基质金属蛋白酶是锌依赖性内肽酶，mmp酶家族负责结缔组织的降解和多种mmps的转录，主要受核因子-κb(nf-κb)和激活蛋白1(ap-1)的调控，后者特异性上调mmp-1(间质胶原酶)、mmp-3(基质分解酶-1)和mmp-9(明胶酶b)，直接参与胶原的降解。ros可以与dna、蛋白质、脂肪酸和糖类反应，造成氧化损伤。ros是多种mapk(丝裂原活化蛋白激酶)通路的必需参与者，mapk信号通路包括erk、p38和jnk三条通路，负责激活蛋白(ap-1)和核因子-κb(nf-κb)的激活，进而上调mmp的表达。jnk主要由ros激活，参与ap-1转录因子的产生。此外，mapks通过erk和p38的磷酸化使nf-κbp65(ser276)磷酸化，最终诱导mmp产生，致皮肤老化和皱纹产生。此外，紫外辐射还会下调转化生长因子β(tgf-β)，这是一种多功能细胞因子，它诱导下游蛋白smad 2/3与smad 4形成异二聚体复合物，并转移到细胞核中，激活前胶原启动子，从而诱导胶原蛋白和弹性蛋白的产生，并阻断mmp-1和mmp-3的生成。

3、功能性活性肽是近年来功能性食品的研究热点，尤其是胶原蛋白在美容方面包括口服和外用均有大量应用和研究报道，一般来说活性肽要能在靶器官发挥功能作用，需要以活性因子的形式通过胃肠道、进入血液循环、然后进入靶器官发挥特定的作用。皮肤作为人体最大的器官，提供了一些活性功能因子进入体内的另一个途径，关于活性肽通过皮肤吸收也有一些研究报道。如mary等综述了多个活性肽可通过皮肤吸收，进而发挥抗皮肤衰老的功效。通过动物实验，无毛老鼠口服来源于鱼鳞胶原蛋白水解物6周，研究胶原蛋白水解物对抗紫外线对皮肤的损伤的效果，结果为相对紫外线照射模型组，胶原蛋白水解物加紫外照射样品组在表皮层厚度与正常组接近，而模型组显著比样品组和正常组高。皮肤胶原蛋白含量，正常组和样品组均显著高于模型组。结果表明胶原蛋白水解物可增强皮肤对抗紫外线损伤的能力。从太平洋鳕鱼中提取明胶，然后用酶水解制得2000～6000u和<2000分子量的肽样品。通过动物实验对其功效进行研究，结果表明胶原蛋白肽可提高雄性icr鼠皮肤组织超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化酶、过氧化氢酶等抗氧化酶系的活性和提高皮肤还原型谷胱甘肽、羟脯氨酸的含量以及降低皮肤丙二醛含量，从而提高皮肤的抗氧化能力，减少皮肤的光损伤。实验结果还表明两个分子量的样品均可保护皮肤中的胶原纤维。在目前的研究中，通常的抗氧化肽均一般均具有抗皱的功能。

4、天然产物具有自然、温和、不刺激、安全性高等优点，随着提取技术、生物技术不断发展和优化，天然植物活性成分稳定性的不断提高，植物原料被用于抗皱、美白等功效性化妆品中。我国人口众多，植物资源丰富，抗衰老化妆品市场和研发潜力巨大。环保、健康、安全的天然组分化妆品的开发是众望所归，回归天然逐渐成为一种趋势。因此，通过酶解工艺优化或其他生物工程技术对肽的制备优化、肽的分离纯化，结构鉴定，开展结合皮肤老化的机理，筛选高效抗皮肤老化活性肽功能因子，并利用筛选出的目标肽段，进一步通过相关技术手段来提高多肽的效果应是未来重点研究方向。

技术实现思路

1、本发明基于现有技术的缺陷，提供了一种改善皮肤活性的多肽。

2、本发明的多肽具有抗氧化、抗皱增加皮肤保湿特性的活性多肽、具体的，本发明的多肽是y2-2-t3，其氨基酸序列如seq id no：1所示。

3、更进一步的，所述的多肽可以被保守的取代或修饰，当时仍然保持相应的多肽活性。

4、具体的，“保守修饰的变体”是指含有保守取代的氨基酸序列。示例性保守修饰的变体包括多肽序列的取代、缺失或插入，其改变、添加或删除多肽序列或编码的多肽序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸，例如，多肽序列或编码的多肽序列中的至多1、2、3、4个或5个氨基酸，或至多0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％或3.5％的氨基酸，任选地，可以是或可以包括化学上相似的氨基酸的氨基酸取代。提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域普通技术人员已知的。这样的保守修饰的变体外加于，而不排除，所公开的修饰的松弛素多肽的多态变体、种间同源物和等位基因。

5、提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域普通技术人员已知的。以下八个组各自含有在彼此之间为保守取代的氨基酸：

6、1)丙氨酸(a或ala)、甘氨酸(g或gly)；

7、2)天冬氨酸(d或asp)、谷氨酸(e或glu)；

8、3)天冬酰胺(n或asn)、谷氨酰胺(q或gln)；

9、4)精氨酸(r或arg)、赖氨酸(k或lys)、组氨酸(h或his)；

10、5)异亮氨酸(i或ile)、亮氨酸(l或leu)、甲硫氨酸(m或met)、缬氨酸(v或val)；

11、6)苯丙氨酸(f或phe)、酪氨酸(y或tyr)、色氨酸(w或trp)；

12、7)丝氨酸(s或ser)、苏氨酸(t或thr)；和

13、8)半胱氨酸(c或cys)、甲硫氨酸(m或met)

14、在两个或更多个多肽序列的语境下，术语“相同”或“同一性”百分比是指两个或更多个相同的序列或子序列。当在比较窗口上比较和比对最大对应性时，或如使用以下序列比较算法(或本领域普通技术人员可用的其他算法)之一或通过手工比对和目测检查来测量指定区域时，如果序列具有相同(即，在指定区域上具有约60％同一性，约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％同一性)的氨基酸残基或核苷酸百分比，则所述序列“基本上相同”。

15、在一些实施方案中，本发明的多肽可以被非天然氨基酸序列取代和修饰。更进一步的，所述至少一个非天然编码氨基酸可包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。所述非天然编码氨基酸可包括苯丙氨酸衍生物。所述非天然编码氨基酸可选自对位取代、邻位取代或间位取代的苯丙氨酸。所述非天然编码氨基酸可选自对位取代、邻位取代或间位取代的苯丙氨酸，其包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。所述非天然编码氨基酸可包括对-乙酰基-l-苯丙氨酸。所述非天然编码氨基酸可以与所述药代动力学增强子连接。例如，所述非天然编码氨基酸可通过肟连接或三唑连接(例如肟连接)与所述药代动力学增强子连接。

16、很多种非天然编码氨基酸适合在本公开中使用。可以将任何数目的非天然编码氨基酸引入到修饰的多肽中。一般而言，引入的非天然编码氨基酸对20种常见的遗传编码氨基酸(即丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)基本上是化学惰性的。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸包括有效地和选择性地与在20种常见氨基酸中发现的官能团反应以形成稳定的共轭物的侧链官能团(包括但不限于叠氮基、酮基、醛基和氨氧基)。例如，包含含有叠氮基官能团的非天然编码氨基酸的修饰的多肽可以与聚合物或pk延长剂反应，

17、本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的多肽和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体；和这样的多肽的分子的组合物在如本文中进一步描述的本发明的方法中的用途。本发明的某些实施方案是药物组合物，其包含本发明的任意多肽；和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。当将治疗有效量的本发明的多肽设计为通过例如静脉内、皮肤或皮下注射来施用时，结合剂将呈无热原的、胃肠外可接受的水溶液的形式。考虑到适当的ph、等渗性、稳定性等，用于制备胃肠外可接受的蛋白溶液的方法是在本领域技术内。除了结合剂之外，用于静脉内、皮肤、或皮下注射的优选药物组合物将含有等渗媒介物诸如氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、含有乳酸盐的林格氏注射液、或本领域已知的其它媒介物。本发明的药物组合物还可以含有稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂、或本领域技术人员众所周知的其它添加剂。

18、具体的，本发明提供的药物组合物含有本发明的多肽，所述的药物组合物用于改善皮肤活性，增加皮肤抗皱活性和抗氧化特性。

19、本发明的药物组合物进一步包含缓冲剂，其可选自由以下组成的组：磷酸钾、乙酸/乙酸钠、柠檬酸/柠檬酸钠、琥珀酸/琥珀酸钠、酒石酸/酒石酸钠、组氨酸/组氨酸hcl、甘氨酸、tris、谷氨酸、乙酸盐及其混合物，并特别地选自磷酸钾、柠檬酸/柠檬酸钠、琥珀酸、组氨酸、谷氨酸、乙酸盐及其组合。适合的缓冲剂浓度涵盖约200mm或更低的浓度，例如约190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、80、70、60、50、40、30、20、10或5mm。技术人员将能够容易地调整缓冲剂浓度以提供如本文所述的药物组合物的稳定性。本发明药物组合物中设想的缓冲剂浓度具体范围从约5至约200mm，优选从约5至约100mm，更优选从约10至约50mm。

20、根据本发明，可以使用盐以例如调整药物配制品的离子强度和/或等渗性和/或进一步改善抗体构建体或其他成分的溶解度和/或物理稳定性。众所周知，离子可以通过与蛋白质表面上的带电荷的残基结合并通过屏蔽蛋白质中的带电荷基团和极性基团并降低其静电相互作用、吸引和排斥相互作用的强度来稳定蛋白质的天然状态。离子还可以通过特别地与蛋白质的变性肽键(--conh)结合来稳定蛋白质的变性状态。此外，与蛋白质中的带电荷基团和极性基团的离子相互作用还可以减少分子间静电相互作用，并且从而防止或减少蛋白质聚集和不溶解。离子种类对蛋白质的作用不同。已经开发了多种对可用于配制根据本发明的药物组合物的离子及其对蛋白质的作用的分类评级。一个实例是hofmeister系列，该系列通过对溶液中蛋白质的构象稳定性的作用来对离子和极性非离子溶质进行评级。稳定溶质称为“亲液的。”不稳定溶质称为“离液的。”通常使用高浓度的亲液剂(例如，>1摩尔硫酸铵)以从溶液中沉淀蛋白质(“盐析”)。通常使用离液剂来使蛋白质变性和/或溶解(“盐溶”)。离子对“盐溶”和“盐析”的相对有效性限定了其在hofmeister系列中的位置。游离氨基酸可在药物组合物中作为膨胀剂、稳定剂和抗氧化剂以及其他标准用途。赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸可用于稳定配制品中的蛋白质。甘氨酸可用于冻干以确保正确的饼结构和特性。在液体配制品和冻干配制品两者中，精氨酸均可用于抑制蛋白质聚集。蛋氨酸可用作抗氧化剂。用于配制药物组合物的特别有用的赋形剂包括蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、精氨酸、赖氨酸、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆188、普朗尼克及其组合。所述赋形剂能以不同的浓度存在于药物组合物中，只要该组合物表现出如本文举例说明的所需特性，并特别是促进所含双特异性单链抗体构建体的稳定化。例如，蔗糖能以2％(w/v)至12％(w/v)的浓度存在于药物组合物中，即浓度为12％(w/v)、11％(w/v)、10％(w/v)、9％(w/v)、8％(w/v)、7％(w/v)、6％(w/v)、5％(w/v)、4％(w/v)、3％(w/v)或2％(w/v)。优选的蔗糖浓度范围为4％(w/v)至10％(w/v)、并且更优选为6％(w/v)至10％(w/v)。聚山梨醇酯80能以0.001％(w/v)至0.5％(w/v)的浓度存在于药物组合物中，即浓度为0.5％(w/v)、0.2％(w/v)、0.1％(w/v)、0.08％(w/v)、0.05％(w/v)、0.02％(w/v)、0.01％(w/v)、0.008％(w/v)、0.005％(w/v)、0.002％(w/v)或0.001％(w/v)。优选的聚山梨醇酯80浓度范围为0.002％(w/v)至0.5％(w/v)、并且优选为0.005％(w/v)至0.02％(w/v)。

21、本发明的药物组合物能以多种形式配制，例如，以固体、液体、冷冻、气体或冻干形式，并且尤其可以是软膏、乳膏、透皮贴剂、凝胶、粉末、片剂、溶液，气溶胶、颗粒、丸剂、悬浮液、乳液、胶囊、糖浆、液体、酏剂、提取物、酊剂或流体提取物形式。

22、关于本发明的药物组合物的施用，剂量范围通常将为约0.0001-100毫克/千克(mg/kg)宿主体重，并且更通常为0.01-5mg/kg宿主体重。示例性剂量可以是0.25mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。一个示例性的治疗方案是每天一次或两次施用，或每周一次或两次施用，每两周一次，每三周一次，每四周一次，每月一次，每两个月或三个月一次或者每三至6个月一次。剂量可以由熟练的健康护理专业人员根据需要选择并重新调节以使对于特定患者而言的治疗益处最大化。

23、本发明的药物组合物典型地将会在多种情形下施用给相同患者。单次剂量之间的间隔可以是，例如，2-5天、每周、每月、每两个月或三个月、每六个月、或每年。基于调节受试者或患者中的血液水平或其它标志物，施用之间的间隔也可以是不规律的。本发明的化合物的剂量方案包括1mg/kg体重或3mg/kg体重的静脉内施用，其中将化合物每两至四周施用一次达六个剂量，然后以3mg/kg体重或1mg/kg体重每三个月施用一次。

24、使用本领域已知的多种方法中的一种或多种，可以经由一种或多种施用途径施用本发明的药物组合物。如技术人员将会理解的，施用的途径和/或模式将会根据期望的结果而变化。本发明的多肽和药物组合物的施用途径包括，例如皮肤表面、静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其它胃肠外施用途径，例如通过注射或输注。在其它实施方案中，本发明的多肽或药物组合物可以通过非胃肠外途径施用，诸如局部、表皮或粘膜施用途径，例如，鼻内地、口服地、皮肤表面涂抹。

25、进一步的，本发明提供的一种改善皮肤特性的化妆品，所述化妆品中含有本发明的多肽，所述的化妆品能够用于改善皮肤活性，增加皮肤抗皱活性和抗氧化特性。