高活性DpnI酶突变体及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物；更具体地，本发明涉及一种高活性dpni酶突变体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、大肠杆菌dna包括两种甲基化修饰碱基：6-甲基腺嘌呤和5-甲基胞嘧啶。大约有2％的腺嘌呤和1％胞嘧啶被进行了修饰。甲基化修饰由三种酶完成，这三种酶分别是dsd甲基化酶、dam甲基化酶和dcm甲基化酶。

2、大肠杆菌dna腺嘌呤甲基转移酶(dna adenine methyltransferase,dam)催化gatc序列中腺嘌呤外环氨基上的氮原子(n6)的甲基化(gm6atc)。dam基因的同源序列在γ-变形菌中和很多它们的噬菌体中是高度保守的。gatc序列中dna腺嘌呤甲基化在甲基化依赖性的细菌基因沉默、dna复制和dna错配修复中起着关键作用。多种受dam依赖性调节的细胞功能紧随着dna复制产生。特别地，由于dam活性相对比较低，因此染色体复制与子染色体链的甲基化之间有延迟。这个延迟对后续的复制错配系统是非常重要的，因为甲基化直接修复染色体子链。另外，dam甲基化也调控大肠杆菌特殊基因的表达等。

3、dpni限制性内切酶分离自双球菌属(formerly diplococcus)的肺炎双球菌(streptococcus pneumoniae)，是一种常见的甲基化修饰依赖性的限制性内切酶，可以识别甲基化的腺嘌呤，但不能识别甲基化的胞嘧啶。在体内，dpni保护细菌不受含dam(adenine-specific dna-methyltransferase)基因的宿主体内繁殖的噬菌体的吞噬，这可能由于dpni特异性识别dam的甲基化产物gm6atc；在体外，dpni可以有效切割被完全甲基化的gatc序列(如两条链)，而当酶浓度较高时，可以切割半甲基化的gatc序列。dpni在识别序列的中间进行切割产生平末端，不像其他修饰依赖性的限制性内切酶是在距离识别序列较远的位置进行切割。

4、dpni识别并酶切由dam基因产物负责的dna双链中腺嘌呤n6位甲基化(n6-methyladenine)的gatc序列(切割点位于ga与tc之间：ga^tc)；dpni识别位点中两个腺嘌呤(gatc及其互补链上均有一个“a”)的n6位都甲基化时，呈现正常的酶活力；只有一个腺嘌呤的n6位甲基化时，酶切活力会降低约60倍。从dam+(dam甲基化酶表达阳性)大肠杆菌菌株如dh5α等提取的质粒的gatc序列中腺嘌呤n6位被甲基化，从而可以被dpni识别和酶切；而从dam-(dam甲基化酶表达阴性)大肠杆菌菌株如jm110等提取的质粒的gatc序列中腺嘌呤n6位没有被甲基化，从而不能被dpni识别和酶切。

5、dpni常被用于基因的定点突变等生物技术中，通过设计基因定点突变的引物，结合pcr方法可以使得提取自大肠杆菌菌株如dh5α的质粒进行扩增。新扩增的含突变位点的环形质粒的gatc序列中腺嘌呤n6位没有发生甲基化，因而在使用dpni进行消化的过程中可以保留下来，而提取自大肠杆菌菌株如dh5α的模板质粒因为gatc序列中腺嘌呤n6位的甲基化而被消化掉；最后将dpni消化后的产物转化大肠杆菌如dh5α就可以筛选得到含突变位点的质粒。

6、bl21(de3)是一种bl21被λ噬菌体de3溶源化的衍生菌株，在lacuv5启动子控制下可表达噬菌体t7 rna聚合酶(相关基因序列已经整合到细菌染色体中)。iptg可以诱导bl21(de3)菌株中t7 rna聚合酶的高表达，因此bl21(de3)菌株适合受t7启动子(t7 promoter)调控的目的基因通过iptg诱导表达。常见的pet系列原核表达载体中目的基因的表达都是受t7启动子调控的，因此都适合用bl21(de3)作为宿主菌。bl21(de3)菌株基因型：f-ompthsdsb(rb-mb-)gal dcm(de3)。

7、在使用普通bl21(de3)菌株表达制备限制性内切酶dpni的时候，dpni会因酶切宿主基因组而表现出很大的毒性，导致表达量很低甚至几乎检测不到。本领域有使用表达dpni的组成型表达载体pgex-6p-1转化dam-(dam甲基化酶表达阴性)的菌株jm110，然后进行限制性内切酶dpni的表达制备。但jm110是通常用于基因质粒扩增的菌株，其扩增的质粒没有甲基化修饰。

8、dpni重组表达的受限性极大困扰了生物技术领域对dpni的生产和应用，急需一种有效可行的方式实现dpni的批量制备。

9、在可实现重组表达的基础上，作为一种具有特别识别位点的限制性内切酶，dpni酶活性的提高也是生物技术领域中亟待解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种高活性dpni酶突变体及其制备方法和应用。

2、本发明的目的还在于提供一种制备dpni酶的方法，包括利用甲基化酶基因dam缺失的菌株进行重组表达，所述dam缺失的菌株通过red重组系统结合cre-loxp系统介导的基因编辑技术将大肠杆菌的dam基因进行基因敲除。

3、在本发明的第一方面，提供一种高效制备dpni酶的方法，包括：(1)提供大肠杆菌表达菌株，所述菌株的甲基化酶基因dam缺失；(2)将编码dpni酶的dna引入(1)的菌株中，培养该重组菌株，表达dpni酶；其中，所述dpni酶为突变型dpni酶或野生型dpni酶。

4、在一种或多种优选实施方式中，步骤(1)中，通过red重组系统结合cre-loxp系统介导的基因编辑技术将大肠杆菌的dam基因进行基因敲除。

5、在一种或多种优选实施方式中，根据dam基因的5’端设计重组臂5hr、3’端设计重组臂3hr，建立重组片段dam-loxp(较佳地还携带抗性筛选基因)；将编码red重组酶的dna引入大肠杆菌，获得表达red重组酶的重组菌株，进一步引入所述dam-loxp，获得甲基化酶基因dam缺失的大肠杆菌表达菌株。

6、在一种或多种优选实施方式中，所述dpni酶为突变型dpni酶，对应于野生型dpni酶的氨基酸序列，具有以下突变：

7、a.选自(a)-(k)的突变或其组合：(a)第223位由n突变为q；(b)第100位由t突变为w或f；(c)第71位由n突变为k；(d)第72位由f突变为w；(e)第206位由l突变为f；(f)第210位由y突变为w；(g)第76位由i突变为f；(h)第13位由y突变为l；(i)第16位由n突变为k；(j)第82位由a突变为k；(k)第245位由f突变为y；

8、b.将a蛋白的氨基酸序列经过一个或多个(如1-15个；较佳地1-10个；更佳地1-5个，如4个，2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有a蛋白功能的由a衍生的蛋白，但对应于a中(a)-(k)所限定的位点是保守的(氨基酸序列不变化)；

9、c.与a蛋白的氨基酸序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性且具有a蛋白功能的由a衍生的蛋白，但对应于a中(a)-(k)所限定的位点是保守的(氨基酸序列不变化)。

10、在本发明的另一方面，提供一种突变型dpni酶，对应于野生型dpni酶的氨基酸序列，其具有：a.选自所述(a)-(k)的突变或其组合；b.将a蛋白的氨基酸序列经过一个或多个(如1-15个；较佳地1-10个；更佳地1-5个，如4个，2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有a蛋白功能的由a衍生的蛋白，但对应于a中(a)-(k)所限定的位点是保守的(氨基酸序列不变化)；c.与a蛋白的氨基酸序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性且具有a蛋白功能的由a衍生的蛋白，但对应于a中(a)-(k)所限定的位点是保守的(氨基酸序列不变化)。

11、在一种或多种优选实施方式中，所述的野生型dpni酶具有seq id no:2所示的氨基酸序列。

12、在本发明的另一方面，提供一种提高dpni酶的酶活性的方法，所述方法通过点突变进行，包括：将dpni酶进行突变改造，形成所述的突变型dpni酶。

13、在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸、含有该多核苷酸的载体或遗传工程化的宿主细胞，所述的多核苷酸编码所述的突变型dpni酶；所述宿主细胞中含有所述载体或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

14、在一种或多种优选实施方式中，所述宿主细胞为原核细胞；较佳地，所述原核宿主细胞包括大肠杆菌。

15、在一种或多种优选实施方式中，所述载体中，所述的多核苷酸的5’端，还包括信号肽、标签多肽、荧光蛋白和/或启动子。所述的多核苷酸的3’端，还包括标签多肽、荧光蛋白和/或终止子。

16、在一种或多种优选实施方式中，与野生型(seq id no:2所示氨基酸序列)dpni酶相比，所述经改造的dpni酶的酶活性提高50％以上；较佳地提高60％以上；更佳地提高80％以上；更佳地提高100％以上；更佳地提高150％以上；更佳地提高700％以上。

17、在本发明的另一方面，提供所述的突变型dpni酶、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物的用途，用于作为限制性内切酶，识别和切割dna双链中腺嘌呤n6位甲基化(n6-methyladenine)的gatc序列。

18、在本发明的另一方面，提供一种特异性识别和切割包含gatc位点且其中a发生n6位甲基化的核酸的方法，包括：利用所述的突变型dpni酶、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物进行切割。

19、在一种或多种实施方式中，所述“甲基化”包括完全甲基化和部分甲基化，完全甲基化是指dpni识别位点gatc中两个腺嘌呤的n6位都被甲基化，所述部分甲基化为gatc位点中只有一个腺嘌呤的n6位甲基化。

20、在一种或多种实施方式中，所述切割在适于反应的体系中进行。例如，所述适于反应的体系中例如包括：反应缓冲液，水。

21、在本发明的另一方面，提供一种用于识别和切割包含gatc位点且其中a发生n6位甲基化的核酸的反应体系或试剂盒，其中含有所述的突变型dpni酶、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物；较佳地，所述试剂盒中含有dpni酶突变体或编码其的多核苷酸的文库，所述文库包括1～12种(较佳地选自前述(a)至(k)所述dpni酶突变体或编码其的多核苷酸。

22、在本发明的另一方面，提供一种用于制备dpni酶的大肠杆菌表达菌株，所述菌株的甲基化酶基因dam缺失；较佳地，所述菌株通过red重组系统结合cre-loxp系统介导的基因编辑技术将大肠杆菌的dam基因进行基因敲除制备获得；更佳地，根据dam基因的5’端设计重组臂5hr、3’端设计重组臂3hr，建立重组片段dam-loxp(较佳地还携带抗性筛选基因)；将编码red重组酶的dna引入大肠杆菌，获得表达red重组酶的重组菌株，进一步引入所述dam-loxp，获得甲基化酶基因dam缺失的大肠杆菌表达菌株。

23、本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。