细胞外囊泡的提取方法及其表面蛋白的检测方法与流程

本发明属于生物检测，具体涉及细胞外囊泡的提取方法及其表面蛋白的检测方法。

背景技术：

1、细胞外囊泡是由细胞释放到细胞外的具有双层膜结构的囊泡结构，其大小从几十纳米到几百纳米，细胞外囊泡作为信号使者，可以通过转运蛋白或核酸，在细胞或器官间进行信号传递；其中，细胞外囊泡表面蛋白在细胞外囊泡与靶细胞之间的相互作用过程中发挥着关键作用，细胞外囊泡表面蛋白，可以作为生物诊断标志物，在疾病诊断方面具有重要的临床应用潜力。

2、细胞外囊泡表面蛋白的种类非常丰富，包括细胞因子、趋化因子、酶等常见的游离蛋白，例如il1、il6、il-8、tgfβ、cxcl12等蛋白；前述细胞外囊泡表面蛋白主要来源于细胞外囊泡从细胞分泌后的外部环境，例如细胞培养基、血浆和血清等，主要通过硫醇作用、静电作用、蛋白相互作用等方式，以蛋白冠的形式存在于细胞外囊泡表面，当细胞外囊泡表面蛋白，同时存在游离形式的蛋白时，将影响细胞外囊泡表面蛋白的检测；因此，对细胞外囊泡表面蛋白进行检测时，一方面，需要保证细胞外囊泡的纯度，避免游离蛋白的污染，同时，需要保证细胞外囊泡表面蛋白的完整性，避免细胞外囊泡表面蛋白的破坏，导致细胞外囊泡表面蛋白信息的丢失。

3、抗体芯片是一种新型便捷、高灵敏、高通量的细胞外囊泡表面蛋白检测工具，其原理是通过芯片上的抗体识别细胞外囊泡表面蛋白，然后通过细胞外囊泡特异性的检测探针，可直接实现微量临床样本中细胞外囊泡表面蛋白的相对定量检测；该检测方法无需进行细胞外囊泡提取，可以保证细胞外囊泡表面蛋白的完整性，同时，该检测方法需要的临床样本用量少，例如只需10微升血浆样本，并且可以规模化，非常适合临床推广；然而，由于临床样本中大量游离蛋白的存在，会与抗体芯片上的抗体结合，导致与细胞外囊泡表面蛋白存在竞争性结合，造成抗体芯片假阴性结果的出现，因此，样本中细胞外囊泡的提纯以及对游离蛋白的去除，将能有效提高抗体芯片对细胞外囊泡表面蛋白的检出率；然而，目前缺乏一种适合微量临床样本、并且操作便捷、纯度高、成本低并且可规模化的细胞外囊泡提取方法。

4、目前，细胞外囊泡的提取方法主要包括超速离心法、聚合物沉淀法、尺寸排阻色谱法以及超滤法等；超速离心法比较适合大体积样本中细胞外囊泡的分离，但其设备昂贵、操作步骤繁琐，且回收率偏低，存在游离蛋白污染、细胞外囊泡破坏与聚集等问题；聚合物沉淀法操作简单且成本低廉，但产物纯度偏低，存在大量非囊泡来源的蛋白质及核酸；尺寸排阻色谱法，采用多孔填料，根据不同大小分子流经的路径长短不同，进行样本分离；细胞外囊泡在填料的排阻极限之外，无法进入填料孔隙中，紧跟着外水体积最先排除，蛋白等其他杂质由于分子量小，可以进入填料孔隙中，经过较长的路径而晚出峰，由此分离；尺寸排阻色谱实验，需要收集多个馏份，细胞外囊泡浓度偏低，且操作繁琐，无法规模化；超滤法是根据截留分子量将体液中的细胞外囊泡与杂蛋白分离开，但体液中成分复杂容易堵塞滤膜，导致细胞外囊泡大量损失，因此，上述方法均不适合微量样本细胞外囊泡的规模化提取，并且存在细胞外囊泡纯度低等缺点。

5、因此，针对现有技术存在的问题，本发明提供一种针对微量临床样本，操作便捷、纯度高、成本低并且可规模化的细胞外囊泡提取方法，并结合抗体芯片，实现细胞外囊泡表面蛋白高灵敏度高通量的检测。

技术实现思路

1、针对上述背景技术所提出的问题，本发明的目的是：旨在提供细胞外囊泡的提取方法及其表面蛋白的检测方法。

2、为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

3、所述细胞外囊泡的提取方法为一种基于吸附层析的细胞外囊泡提取方法,

4、包括以下步骤：

5、s1：样本预处理：取含细胞外囊泡的微量样本，将微量样本经3000g离心15min后，取10μl上清，再利用pbs缓冲液将10μl上清稀释至100μl，备用；

6、s2：纯化柱预处理：取装有200μl填料的纯化柱，将纯化柱的柱子置于2ml收集管中；

7、s3：向纯化柱中加入500μl pbs缓冲液，将纯化柱，500g离心30s，丢弃滤液；

8、s4：细胞外囊泡的纯化：将s1中稀释好的100μl微量样本，加入至纯化柱中，500g离心60s，收集滤液，共收集100μl纯化好的细胞外囊泡；

9、s5：取尺寸排阻色谱柱，柱平衡，取含细胞外囊泡的微量样本，将微量样本经3000g离心15min后，取10μl上清，再利用pbs缓冲液将10μl上清稀释至150μl，然后加入尺寸排阻色谱柱，弃去最初流出的1ml滤液，之后收集含有细胞外囊泡的多个馏份，共收集600μl的细胞外囊泡；

10、所述微量样本的体积小于100μl；

11、所述纯化柱中的填料，其外部包含惰性外壳，其内部含有强吸附、多模式配基辛胺基团，兼具阴离子交换和疏水作用，小于20nm的蛋白以及核酸分子可以进入填料内部被填料内部的基团吸附，而大于20nm的细胞外囊泡则被排阻在外，能够直接流穿。

12、所述细胞外囊泡表面蛋白的检测方法基于抗体芯片进行,包括以下步骤：

13、s1：取经纯化柱分离的细胞外囊泡，加入抗体芯片，室温孵育60min:；

14、s2：经洗涤后，加入细胞外囊泡特异性检测探针，室温孵育60min；

15、s3：加入荧光染料，再利用荧光显微镜进行信号检测；

16、s4：提取荧光数值，进行细胞外囊泡表面蛋白的相对定量分析。

17、进一步限定，所述纯化柱的填料柱体积为200μl。

18、进一步限定，所述纯化柱的规格为单个离心柱或96孔板。

19、进一步限定，所述包含细胞外囊泡的微量样本的种类包括细胞培养上清、血浆、血清、尿液、唾液、腹水、脑脊液、肺泡灌洗液和尿液。

20、进一步限定，所述抗体芯片上的抗体，为能够特异性识别细胞外囊泡表面蛋白的抗体。进一步限定，所述细胞外囊泡特异性检测探针为偶联生物素的抗cd63抗体、抗cd81抗体和抗cd9抗体的一种或组合。

21、进一步限定，所述荧光染料为偶联链霉亲和素的荧光染料。

22、本发明的原理如下：

23、所采用吸附层析方法提取细胞外囊泡，具有吸附型尺寸排阻色谱的作用，小于20nm的游离蛋白和核酸等小分子可以进入填料内部，被填料内部的基团吸附，填料外部是惰性外壳，大于20nm的细胞外囊泡可以直接流穿，之后利用新型便捷、高灵敏且高通量的抗体芯片检测细胞外囊泡表面蛋白的相对表达量。

24、本发明的有益效果如下：

25、1.本发明解决了微量样本细胞外囊泡的提取问题，采用吸附层析的纯化方法，相比于常规尺寸排阻色谱法，能够通过填料对小分子的吸附作用，更有效地去除游离蛋白，从而提高细胞外囊泡的纯度。

26、2.本发明解决了微量样本细胞外囊泡规模化提取的问题，本方案的细胞外囊泡提取方法，操作便捷，只需简单离心操作，便于批量化操作，并且成本较低，因此利用规模化推广，适合大规模临床样本细胞外囊泡的提取，并结合抗体芯片，实现细胞外囊泡表面蛋白高灵敏度高通量的检测，将有助于细胞外囊泡诊断标志物的开发，促进细胞外囊泡的临床诊断应用。

27、3.本发明解决了抗体芯片检测细胞外囊泡表面蛋白时游离蛋白干扰的问题，能够有效降低抗体芯片检测细胞外囊泡表面蛋白的假阴性结果，提高抗体芯片的检测灵敏度。