LncRNASFFD及其在猪卵巢颗粒细胞中的应用

本发明属于细胞工程和基因工程，特别涉及一种lncrna sffd及其在猪卵巢颗粒细胞中的应用。

背景技术：

1、颗粒细胞(granulosa cells，gcs)的生长和功能在卵泡成熟中起主导作用。gcs的增殖和e2分泌促进卵泡生长，而gcs过度凋亡导致大量卵泡闭锁。众所周知，lncrna通过碱基配对方式竞争性吸附mirna，进而调节gcs的生长、功能及卵泡发育。例如，在绵羊中，lncrna fdncr通过mir-543-3p/dcn/tgf-β轴促进gcs凋亡。lncrna znf674-as1表达下调显著抑制gcs增殖和卵泡生长。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种lncrna sffd。

2、本发明的另一目的在于提供上述lncrna sffd在猪卵巢颗粒细胞中的应用。

3、本发明的再一目的在于提供抑制lncrna sffd表达的小干扰rna片段(sirna)。

4、在本发明中，我们发现一种新的lncrna，根据其功能命名为卵泡发育促进因子(stimulatory factor of follicular development，sffd)。lncrna sffd位于猪线粒体染色体，全长734bp。

5、本发明的目的通过下述技术方案实现：

6、本发明提供一种lncrna sffd，其核苷酸序列如seq id no：1所示。

7、上述lncrna sffd相关的生物材料，为下述生物材料中的任意一种或多种组合；

8、1)编码所述lncrna sffd的dna分子；

9、2)含有1)中所述dna分子的表达盒；

10、3)含有1)中所述dna分子的重组载体，或含有2)中所述表达盒的重组载体；

11、4)抑制所述lncrna sffd表达的小干扰rna片段(sirna)；

12、5)含有1)中所述dna分子的重组细胞，或含有2)中所述表达盒的重组细胞，或含有3)所述重组载体的重组细胞，或转染有4)中所述小干扰rna片段的重组细胞。

13、进一步的，1)中所述dna分子可通过如下方式制备得到：提取猪卵巢颗粒细胞的rna，将其逆转录成cdna，以cdna为模板进行pcr扩增，得到dna分子。

14、更进一步的，pcr扩增所用引物如下所示：

15、lncrnasffd forward：

16、lncrnasffd reverse：

17、进一步的，3)中所述重组载体可通过如下方式制备得到：将所述dna分子插入至pcdna3.1载体的hind iii和kpn i酶切位点之间，得到重组载体；

18、所述dna分子的序列如seq id no：2所示。

19、进一步的，4)中所述小干扰rna片段如下所示：

20、si-lnc sffd-1：5′-ggaacaauaguaagcacaauc-3′；

21、si-lnc sffd-2：5′-guagcccauuucuuuccaa-3′；

22、上述lncrna sffd或上述lncrna sffd相关的生物材料在猪卵巢颗粒细胞中的应用。

23、体外环境下，lncrna sffd能促进猪卵巢颗粒细胞的增殖，和/或抑制猪卵巢颗粒细胞的凋亡。

24、进一步，上述lncrna sffd或上述lncrna sffd相关的生物材料在制备调控猪卵巢颗粒细胞增殖和/或凋亡的药物中的应用。

25、所述的调控猪卵巢颗粒细胞的增殖和/或凋亡通过如下方式实现：

26、增加lncrna sffd促进猪卵巢颗粒细胞的增殖，抑制猪卵巢颗粒细胞的凋亡；或减少lncrna sffd抑制猪卵巢颗粒细胞的增殖，促进猪卵巢颗粒细胞的凋亡；

27、更进一步的，具体为下述应用中的任意一种或多种组合：

28、a)增加lncrna sffd，促进猪卵巢颗粒细胞的增殖；

29、b)增加lncrna sffd，抑制猪卵巢颗粒细胞的凋亡；

30、c)减少lncrna sffd，抑制猪卵巢颗粒细胞的增殖；

31、d)减少lncrna sffd，促进猪卵巢颗粒细胞的凋亡。

32、上述lncrna sffd或上述lncrna sffd相关的生物材料在调控猪卵巢颗粒细胞中e2(雌二醇)生成的应用。

33、所述的调控猪卵巢颗粒细胞中e2(雌二醇)生成通过如下方式实现：

34、增加lncrna sffd促进e2的生成；和/或减少lncrna sffd抑制e2的生成。

35、所述的增加lncrna sffd为通过增加外源性lncrna sffd的方式实现；

36、所述的减少lncrnasffd为抑制lncrna sffd表达的sirna转染到猪卵巢颗粒细胞的方式实现。

37、所述的增加外源性lncrnasffd通过如下方法实现：将lncrna sffd连接到pcdna3.1载体上，构建含有lncrnasffd的超表达载体；然后将含有lncrna sffd的超表达载体转染到猪卵巢颗粒细胞中。

38、本发明提供抑制lncrna sffd表达的sirna，序列如下：

39、si-lnc sffd-1：5′-ggaacaauaguaagcacaauc-3′；

40、si-lnc sffd-2：5′-guagcccauuucuuuccaa-3′。

41、本发明的验证结果如下：

42、1、合成2对干扰lncrna sffd的小片段/对照(si-lnc sffd/sirna-nc)，筛选并检测其干扰效率。结果可知，将基因干扰小片段转染到卵巢颗粒细胞中，通过qrt-pcr手段，最终筛选干扰效果较好的si-lnc sffd-2小片段进行后续实验。

43、si-lnc sffd-2：5′-guagcccauuucuuuccaa-3′；

44、2、我们分别将pcdna3.1-lnc sffd或si-lnc sffd(si-lnc sffd-2)转染到卵巢颗粒细胞，利用qrt-pcr、wb和edu法分别检测lncrna sffd对颗粒细胞增殖相关基因表达和增殖的影响。qrt-pcr和wb结果显示，pcdna3.1-lnc sffd促进细胞周期相关基因(pcna、cdk1、ccna1和ccnd1)的表达水平。edu染色显示，pcdna3.1-lnc sffd组的细胞增殖率显著高于pcdna3.1组。同时，si-lnc sffd抑制pcna、cdk1和ccnd1的表达水平。si-lnc sffd组的细胞增殖率显著低于sirna-nc组。综上，lncrna sffd能促进猪卵巢颗粒细胞的增殖。

45、3、我们分别将pcdna3.1-lnc sffd或si-lnc sffd(si-lnc sffd-2)转染到卵巢颗粒细胞，利用qrt-pcr、wb和annexin v-fitc法分别检测lncrna sffd对颗粒细胞凋亡相关基因表达和凋亡的影响。qrt-pcr和wb结果显示，pcdna3.1-lnc sffd抑制细胞促凋亡相关基因(caspase3、caspase8和caspase9)的表达水平。流式细胞仪分析结果显示，pcdna3.1-lnc sffd组的细胞凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)显著低于pcdna3.1组。同时，si-lnc sffd促进caspase3、caspase8和caspase9的表达水平。si-lnc sffd组的细胞凋亡率显著高于sirna-nc组。综上，lncrnasffd能抑制猪卵巢颗粒细胞的凋亡。

46、4、我们分别将pcdna3.1-lnc sffd或si-lnc sffd(si-lnc sffd-2)转染到卵巢颗粒细胞，利用qrt-pcr、wb和elisa法分别检测lncrna sffd对颗粒细胞e2分泌相关基因表达和e2分泌的影响。qrt-pcr和wb结果显示，pcdna3.1-lnc sffd促进细胞e2分泌相关基因(cyp11a1、hsd17b1和hsd3b1)的表达水平。elisa结果显示，pcdna3.1-lnc sffd组的e2浓度显著高于pcdna3.1组。同时，si-lnc sffd抑制cyp11a1、hsd17b1和hsd3b1的表达水平。si-lnc sffd组的e2浓度显著低于sirna-nc组。综上，lncrna sffd能促进猪卵巢颗粒细胞e2的分泌。

47、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

48、(1)lncrnasffd可能直接或间接参与了卵泡闭锁、卵泡成熟以及性成熟，本发明是以lncrna sffd(见seq id no：1)为研究对象，采用了分子和细胞生物学方法研究其在猪卵巢颗粒细胞中的应用：lncrna sffd可抑制卵巢颗粒细胞的凋亡和促进增殖以及e2分泌。对研究卵巢卵泡闭锁以及性成熟延迟等具有很好的应用价值。

49、(2)本发明技术方案设计周详，结果可靠。为证实lncrna sffd对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡以及e2分泌的影响，本发明从多层次、多角度验证，在相关信号通路基因、mrna以及蛋白水平验证，最后在卵巢颗粒细胞的表型上验证。