突变型PSTDNA聚合酶及其制备方法与应用与流程

本发明涉及基因工程，尤其是涉及一种突变型pst dna聚合酶及其制备方法与应用。

背景技术：

1、dna聚合酶是一类能够在dna模板链上将脱氧核苷酸连续地加到双链dna分子引物链的3'-oh末端，催化核苷酸聚合成以模板互补的dna序列的酶，常用于催化dna的体外合成。通常dna聚合酶可分为以下几个种类：大肠杆菌dna聚合酶、大肠杆菌dna聚合酶i、klenow酶、t7 dna聚合酶、修饰的t7 dna聚合酶、taq dna聚合酶及反转录酶等。这些聚合酶的共同特点是具有催化核苷酸聚合能力和外切酶活性。

2、相关技术中，当基于dna聚合酶和纳米孔的边合成边测序技术(sequence bysynthesis，sbs)使用寡核苷酸修饰的底物来进行测序时，采用常规的dna聚合酶进行扩增，存在难以利用不同分子量的寡核苷酸修饰底物进行延伸、测序效果不理想的缺点。

3、基于此，亟需寻求一种新的dna聚合酶，其能够利用不同分子量的寡核苷酸修饰底物进行延伸，进而提高测序效果。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出了一种突变型pst dna聚合酶，该聚合酶能够利用不同分子量的寡核苷酸修饰底物在高盐条件下进行延伸。

2、本发明还提出了一种生物材料。

3、本发明还提出了一种酶制剂。

4、本发明还提出了一种上述突变型pst dna聚合酶的制备方法。

5、本发明还提出了一种上述的突变型pst dna聚合酶在核酸的扩增或测序中的应用。

6、本发明还提出了一种上述的突变型pst dna聚合酶在制备耐盐的纳米孔测序试剂盒中的应用。

7、本发明的第一方面，提供了一种突变型pst dna聚合酶，包括如seq id no.5所示的氨基酸序列经过以下突变后的氨基酸序列：第404位的天冬氨酸突变为天冬酰胺、第408位的丙氨酸突变为谷胺酰胺、第430位的天冬氨酸突变为甘氨酸或天冬酰胺。

8、根据本发明实施例的突变型pst dna聚合酶，至少具有如下有益效果：本发明发现对pst dna聚合酶的底物进口区进行突变，如将如seq id no.5所示的pst dna聚合酶编码氨基酸的第404位的天冬氨酸突变为天冬酰胺、第408位的丙氨酸突变为谷胺酰胺、第430位的天冬氨酸突变为甘氨酸或天冬酰胺，能够扩大进口区以及改变进口区的电荷性质，进而调控pst dna聚合酶对不同分子量底物的延申结合能力。

9、在本发明的一些实施方式中，所述突变还包括：第426位丝氨酸突变为丙氨酸、第334位亮氨酸突变为丝氨酸、第335位谷氨酸突变为谷胺酰胺、第336位谷氨酸突变为丙氨酸、第283位谷胺酰胺突变为甘氨酸、第266位谷氨酸突变为丙氨酸中的至少一种。

10、优选地，所述突变包括：第404位的天冬氨酸突变为天冬酰胺、第408位的丙氨酸突变为谷胺酰胺、第430位的天冬氨酸突变为天冬酰胺和第426位丝氨酸突变为丙氨酸。

11、优选地，所述突变包括：第404位的天冬氨酸突变为天冬酰胺、第408位的丙氨酸突变为谷胺酰胺、第430位的天冬氨酸突变为天冬酰胺、第426位丝氨酸突变为丙氨酸、第334位亮氨酸突变为丝氨酸、第335位谷氨酸突变为谷胺酰胺和第336位谷氨酸突变为丙氨酸。

12、优选地，所述突变包括：第404位的天冬氨酸突变为天冬酰胺、第408位的丙氨酸突变为谷胺酰胺、第430位的天冬氨酸突变为天冬酰胺、第426位丝氨酸突变为丙氨酸、第334位亮氨酸突变为丝氨酸、第335位谷氨酸突变为谷胺酰胺、第336位谷氨酸突变为丙氨酸、第283位谷胺酰胺突变为甘氨酸和第266位谷氨酸突变为丙氨酸。

13、在本发明的一些实施方式中，所述dna聚合酶的氨基酸序列如seq id no.1至4中任一种所示。

14、优选的，所述dna聚合酶的氨基酸序列如seq id no.2或seq id no.4所示。

15、根据本发明的一些实施例，在本发明的突变型pst dna聚合酶的氨基酸序列的n端或/和c端可以连接标签或dna结合结构域。

16、根据本发明的一些实施例，所述标签包括利于dna聚合酶的溶解、纯化和检测的标签中的至少一种。可以理解的是，本发明的dna聚合酶可以包含一个或多个标签；多个标签可以包含多个相同标签的组合，也可以为多个不同标签的组合。例如：利于dna聚合酶溶解的标签包括但不限于nus标签或麦芽糖结合蛋白；利于dna聚合酶纯化的标签包括但不限于strep标签、his标签、gst标签、pelb信号序列或ompa信号序列；利于dna聚合酶检测的标签包括但不限于辣根过氧化物酶(hrp)、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白(gfp)、hcred、dsred或青色荧光蛋白(cfp)。所述标签具体可以为strep标签。

17、根据本发明的一些实施例，所述dna结合结构域包括但不限于sso7d、dbd、hi中的至少一种。a2)中所述dna聚合酶至少具有与a1)中所述dna聚合酶相同的功能；包括但不限于无外切酶活性、耐盐性。

18、本发明的第二方面，提供生物材料，所述生物材料为a1)至a4)中的任一种：

19、a1)、编码第一方面任一项所述的dna聚合酶的核酸分子；

20、a2)、含有a1)所述核酸分子的表达盒；

21、a3)、含有a1)所述核酸分子或a2)所述表达盒的重组载体；

22、a4)、含有a1)所述核酸分子、a2)所述表达盒或a3)所述重组载体的宿主细胞。

23、在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no.6至seqid no.9任一项所示。

24、本发明的第三方面，提供了一种酶制剂，包括第一方面任一项所述的dna聚合酶。

25、本发明的第四方面，提供了一种dna聚合酶的制备方法，包括以下步骤：

26、将含第一方面任一项所述的dna聚合酶的编码基因的表达载体导入宿主细胞中，使所述编码基因得到表达，得到所述dna聚合酶。

27、在本发明的一些实施方式中，所述宿主细胞为原核细胞；优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。

28、本发明的第五方面，提供了第一方面任一项所述的dna聚合酶在核酸的扩增或测序中的应用。

29、在本发明的一些实施方式中，所述扩增包括环介导扩增(lamp)、滚环扩增(rca)、链置换扩增(sda)、多重置换扩增(mda)和交叉引物扩增(cpa)中的至少一种。

30、在本发明的一些实施方式中，所述扩增或测序的反应试剂包括反应缓冲液、核苷酸底物、bsa、kcl中的至少一种。

31、在本发明的一些实施方式中，所述扩增或测序中所使用的核苷酸底物包括非天然核苷酸底物。

32、在本发明的一些实施方式中，所述扩增或测序中所使用的核苷酸底物包括聚合物标记的核苷酸d8g和/或a30a。

33、本发明的第六方面，提供了第一方面任一项所述的dna聚合酶在制备耐盐的纳米孔测序试剂盒中的应用。

34、纳米孔测序时增加电解槽中盐溶液的浓度，有利于提高测试过程中的信噪比以及检测结果的准确性，提升测序质量。然而传统的dna聚合酶的耐盐性较差，所以如果增加电解槽的盐溶液的浓度，则dna聚合酶的活性降低，不利于提高测序速度，而本发明的突变型pst dna聚合酶不仅具有较好的耐盐性，而且能够利用不同分子量的寡核苷酸修饰底物进行延伸，可广泛应用于纳米孔测序中。

35、在本发明的一些实施方式中，所述纳米孔测序试剂盒包括具有纳米孔的测序组件和含有所述dna聚合酶的检测试剂。

36、在本发明的一些实施方式中，所述纳米孔测序试剂盒的反应体系包括50nm～500nm的核酸模板、100nm～500nm的所述dna聚合酶、20mm～50mm的tris-hcl、2mm～20mm的mg2+、10mm～40mm的(nh4)2so4、4mm～20mm的dtt、0.2mm～0.5mm的dntps、以及0mm～500mm的nacl或0mm～500mm的kcl。

37、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。