一种卤醇脱卤酶突变体及其在合成手性环氧氯丙烷中的应用

(一)本发明涉及酶工程，具体涉及一种卤醇脱卤酶突变体及其在合成手性环氧氯丙烷中的应用。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、卤醇脱卤酶(hhdh,ec.4.5.1.x)，能够催化邻卤醇脱卤生成相应的环氧化物，且不需要任何辅助因子参与。此外，在带负电荷的亲核试剂(如卤化物、叠氮化物、氰化物或亚硝酸盐)存在下，能够催化环氧化物开环，并形成新的c-n、c-c、c-o或c-s键，生成相应的β-取代醇。由于具有严格的立体选择性，卤醇脱卤酶在合成手性环氧化物和手性醇中展现出巨大的潜力。卤醇脱卤酶具有高度保守的催化三联体(ser-tyr-arg)，其中丝氨酸残基与底物羟基氧原子形成氢键，将底物卤醇固定在活性位点内。精氨酸残基与底物不直接产生相互作用，而是通过氢键降低酪氨酸的pka值，增强酪氨酸残基获得质子的能力，使其从底物羟基中获得氢离子。底物羟基上的氧负离子作为亲核试剂进攻邻位卤素取代的碳原子，进而释放卤素离子，形成环氧环。

2、手性环氧氯丙烷(ech)是一种重要的三碳手性化合物，用于制备他汀类降血脂药物、芳氧丙胺醇类β-肾上腺素阻断剂等多种药物，在医药、农药和精细化工等领域应用广泛，市场需求不断攀升。目前，工业上采用的外消旋环氧氯丙烷动力学水解开环工艺存在理论产率仅为50％以及salen催化剂回用困难等缺陷。因此，开发绿色、高效的手性环氧氯丙烷合成技术具有重要意义。

3、卤醇脱卤酶不对称催化合成手性环氧氯丙烷的报道较少，且主要集中于(s)-环氧氯丙烷的不对称合成。tetsuje等利用corynebacterium sp.n-1074卤醇脱卤酶hheb催化5mm 1,3-二氯丙醇合成(r)-环氧氯丙烷。反应初始阶段(r)-环氧氯丙烷的ee值可达90％，但随着反应的进行，ee值逐渐下降。薛锋等从bradyrhizobium erythrophlei基因组中获得卤醇脱卤酶hheb8，建立了重组hheb8催化1,3-二氯丙醇合成(r)-环氧氯丙烷工艺，ee值最高为93.4％。

4、近年来，随着基因测序、基因合成等技术的发展，新的卤醇脱卤酶不断被挖掘、表征和改造。但是，野生型卤醇脱卤酶对1,3-二氯丙醇等人工底物并不具有严格的立体选择性，无法获得高光学纯度的产物，限制了卤醇脱卤酶的工业应用。

技术实现思路

0、(三)
技术实现要素：

1、本发明目的是提供一种来源于丙酸杆菌(propionicicella superfundia)的具有高度立体选择性的卤醇脱卤酶突变体及其在催化合成(r)-环氧氯丙烷中的应用，解决了卤醇脱卤酶催化1,3-二氯丙醇脱卤立体选择性不高等问题。

2、本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供一种来源于丙酸杆菌(propionicicella superfundia)的卤醇脱卤酶突变体，所述卤醇脱卤酶突变体是将seq id no.2所示氨基酸序列的第87位、88位氨基酸进行单位点突变或多位点突变获得的。

4、本发明所述卤醇脱卤酶突变体是以ps_wt为亲本，其氨基酸序列如seq id no.2所示，核苷酸序列如seq id no.1所示，选择其底物口袋附近的位点进行定点饱和突变，得到催化活力和立体选择性等性能显著提高的卤醇脱卤酶突变体。

5、优选的，所述卤醇脱卤酶突变体是将seq id no.2所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第87位天冬酰胺突变为赖氨酸，氨基酸序列如seq id no.4所示，记为ps_n87k；(2)第87位天冬酰胺突变为赖氨酸，第88位精氨酸突变为苯丙氨酸，氨基酸序列如seq id no.6所示，记为ps_n87k/r88f。

6、由于氨基酸的特殊性，对上述卤醇脱卤酶突变体的其他氨基酸位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端截断的形式，这些突变体形式也包括在本发明的范围内。

7、本发明还提供了所述卤醇脱卤酶突变体的编码基因，其中突变体ps_n87k编码基因的核苷酸序列如seq id no.3所示，ps_n87k/r88f编码基因的核苷酸序列如seq id no.5所示。

8、本发明还提供了包含所述卤醇脱卤酶突变体编码基因的重组载体。作为优选，原始载体为pet-28a。

9、本发明还提供了由所述重组载体构建的重组基因工程菌。所述重组载体转化宿主细胞获得重组基因工程菌，所述宿主细胞可以为本领域的各种常规宿主细胞，作为优选，宿主细胞为大肠杆菌e.coli bl21(de3)。重组表达转化体所用的培养基可以是本领域可使转化体生长并产生本发明的卤醇脱卤酶的培养基，优选lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，氯化钠10g/l，溶剂为水，ph7.0。培养方法和培养条件没有特别要求，只要使转化体能够生长并产生卤醇脱卤酶即可。

10、本发明构建所述卤醇脱卤酶突变体的方法包括以下步骤：

11、(1)设计定点突变引物，以携带有核苷酸序列如seq id no.1所示的重组质粒为模板，进行重叠延伸pcr，获得亲本卤醇脱卤酶氨基酸序列中第87位n突变为k的突变产物；

12、(2)以步骤(1)获得的携带有ps_n87k基因的突变产物为模板，进行重叠延伸pcr，获得第88位r突变为f的突变产物；

13、(3)将步骤(1)、(2)获得的突变产物分别转化至宿主菌，筛选获得卤醇脱卤酶突变体表达菌株，测序结果正确者即为目标菌株，经诱导表达获得所述的卤醇脱卤酶突变体ps_n87k和ps_n87k/r88f。

14、本发明还提供一种所述卤醇脱卤酶突变体在催化1,3-二氯丙醇合成(r)-环氧氯丙烷中的应用，所述的应用为：以含有卤醇脱卤酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养离心获得的湿菌体为催化剂，以1,3-二氯丙醇为底物，以ph为7～12的缓冲液为反应介质构成反应体系，在20～55℃、400～800rpm条件下反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得(r)-环氧氯丙烷。

15、本发明催化剂可以是所述的卤醇脱卤酶突变体工程菌全细胞，还可以是湿菌体固定化细胞、湿菌体超声破碎后提取的酶或者固定化酶，其中酶包括未经纯化的粗酶、部分纯化的或完全纯化的酶。所述固定化细胞或者固定化酶利用本领域已知的固定化技术将本发明的卤醇脱卤酶突变体制成固定化酶或固定化细胞形式的生物催化剂。

16、优选的，所述反应体系中，底物加入浓度为30～100mmol/l(优选50mmol/l)，催化剂的用量以湿菌体重量计为5-20g/l(10g/l)，其中湿菌体质量含水量为70～90％。

17、优选的，所述反应介质为0.5m、ph10.5的gly-naoh缓冲液与乙酸乙酯以体积比4:6混合液。

18、优选的，催化反应条件为：温度为37℃、800rpm。

19、优选的，所述的湿菌体按如下方法制备：

20、将含卤醇脱卤酶突变体编码基因的重组工程菌(优选e.coli bl21(de3)/pet28a-ps_n87k、e.coli bl21(de3)/pet28a-ps_n87k/r88f)接种至含50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃培养12h，获得种子液；再将种子液以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃培养至菌体浓度od600达到0.4～0.6，再向培养液中加入终浓度为0.1mm异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)，28℃诱导培养12h，4℃、12000rpm条件下离心10min，收集湿菌体，即为催化剂。

21、与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

22、本发明的卤醇脱卤酶突变体可以作为催化剂应用于制备(r)-环氧氯丙烷，相对于其他的卤醇脱卤酶，本发明的卤醇脱卤酶突变体具有更高的活力和立体选择性，产物(r)-环氧氯丙烷的ee值达到98％以上，具有良好的工业应用前景。

23、与亲本卤醇脱卤酶ps_wt相比，突变体ps_n87k催化合成(r)-环氧氯丙烷的活力为野生型的2.2倍，而催化合成(s)-环氧氯丙烷的活力为野生型的18.5％，产物(r)-环氧氯丙烷的ee值由22.8％提高至92.4％；突变体ps_n87k/r88f催化合成(r)-环氧氯丙烷的活力为野生型的1.99倍，而催化合成(s)-环氧氯丙烷的活力为野生型的9.2％，产物(r)-环氧氯丙烷的ee值由22.8％提高至98.1％。