一种野外水质现场检测的联合急性毒性测试方法与流程

本发明属于水质检测，具体涉及一种野外水质现场检测的联合急性毒性测试方法。

背景技术：

1、从20世纪 60年代开始，环境问题日益受到重视，迫切需要快速、灵敏、低成本的生物检测方法，因此发光菌用于环境污染毒性检测的研究越来越多，至70年代末、明亮发光杆菌、费氏弧菌等几种海洋发光菌被用于水环境毒性检测。随着发光菌检测方法的深入研究合和应用，发光菌检测毒性物质的应用范围不断扩大，包括土壤、空气、固体废物污染物甚至是食品安全、饮用水安全等领域也采用发光细菌作为毒性快速检测的重要手段。

2、目前常用的发光菌毒性测试是20世纪70年代后兴起的一种微生物监测环境污染及检测污染物毒性的新方法。1978年美国beckman公司即推出功能完备的生物发光光度计“microtox”，自此，这一急性毒性测试技术在世界范围内迅速推广。因此人们也将发光菌毒性测试称为microtox测试。采用现代光电检测手段(生物发光光度计)的发光菌生物毒性实验是毒理学中生物测定的方法之一。该方法快速、简便、灵敏、廉价，在有毒物质的筛选，环境污染生物学评价等方面有重要的意义，因而备受各国有关研究者的关注。1995年3月，国家环境保护局、国家技术监督局将发光菌毒性测试定为水质监测标准方法(gb/t 15441-1995)。

3、现有技术的发光细菌法用于急性毒性测试方法，包括常规的实验室内进行的急性毒性测试以及涉及发光细菌法的综合生物毒性在线监测自动分析仪器。国家标准《水质急性毒性的测定 发光细菌法》（gb/t15441-1995）规定了适用于测定工业废水、纳污水体等水环境急性毒性以及实验条件下可溶性化学物质的发光细菌急性毒性测试方法，但标准方法仅适用于实验室内进行水样品和化学物质的急性毒性分析测试，例如，中国发明申请公布号cn 111925924 a的文献公开了一种基于发光细菌的水质综合生物毒性测试装置及测试方法，其提供的测试装置包括装置主体、第一活化装置、第二活化装置、活化菌液存储罐、待测样制备装置、水质取样装置、分析测试装置、交互装置和清洗装置，第一活化装置包括发光菌存储罐一、活化室一、营养液罐、缓冲液罐，第二活化装置包括发光菌存储罐二、活化室二和升温装置，活化菌液存储罐分别与活化室一、活化室二连接，待测样制备装置包括制备室、驱动电机、待测样本盘、待测样本容器、水质样加液管、缓冲液加液管、活化菌液加液管和清洗水加液管。由此可见，现有技术的测试装置及测试方法均较为繁琐，难以适用于野外现场的快速性毒性分析测试。此外，现有技术采用制备发光细菌冻干粉工作菌液所需的时间较长，同时对复溶的环境温度、空气洁净度等条件均具有相应的要求，以确保获得足够数量的活性菌株并且不被环境中的杂菌污染。例如，申请公布号为cn102465167 a的文献公开了一种发光细菌的快速、高通量急性毒性测试方法，采用发光细菌冻干粉或冷冻保存的冻存管，在20℃条件下快速解冻，向管中加入1.0ml复苏溶液，混合均匀后，小心将管中的混合液转入100ml复苏溶液，在20℃条件下以500转/分钟的速度搅拌30分钟；然后在一只96微孔板上，用8通道移液器向微孔板中移入245μl体积的待测样品溶液，然后再快速向每孔移入5μl体积的工作菌液、开始计时；暴露15分钟后在化学发光酶标仪上测试微孔板每个孔的发光强度,并记录结果。由此可见，其工作菌液的制备时间长（30分钟以上）、所需的暴露时间长（15分钟以上），而且其采用的传统化学发光酶标仪也无法携带到野外现场工作。

4、现有技术中，常用的发光细菌为海洋细菌，利用海洋发光细菌进行环境样品生物毒性测试，为维持其活性需要在检测过程中加入一定量的nacl（2%-3%），对淡水体系样品中污染物毒性的检测造成影响和限制，而我国发现的淡水青海弧菌恰好可以避免应用海洋发光细菌方法的不足，发挥其在淡水中即可发光的优势。青海弧菌在淡水体系中能正常发光，并且温度适应范围广，在10℃-35℃均能发光；作为一种淡水型发光细菌，青海弧菌除了对na+没特别要求这一特性外，确实还有其独特之处，新鲜培养的青海弧菌能再蒸馏水里能良好发光，且稳定的发光能维持30min以上，因此在淡水样品检测中，可用蒸馏水做空白对照，而淡水样品也不必要作任何额外添加物，直接将青海弧菌加进去就能进行测试。此外，由于该菌对环境ph值有较宽的适应能力，在ph值范围6.0-9.0均能正常发光，也就是ph值对青海弧菌的发光影响可以忽略不记，因而一般不需要对样品的ph做调整就可用于检测。青海弧菌是唯一的非致病型淡水发光菌，其冻干粉在运输、使用过程中安全可靠，废弃的菌液无需特殊处理，不会引起二次污染。

5、现有技术中，许多研究方法均可以解决单一毒性物质（无机物或有机物）的急性毒性检测问题，但是对于同时包括两种或者多种毒性物质的联合检测，并且确定二者对于整体的联合毒性效应，还缺乏有效的研究手段。而采用当前的发光菌液检测法，需要分别进行多次检测才能得到相应的结果，需要消耗较多的监测材料和检测时间。

6、青海弧菌q67（ vibrio qinghaiensis sp.nov.  q67）是一种我国确定的淡水发光细菌，其发光强度随毒物浓度改变的特性使其可作为水质检测的指示菌株，当处菌株于正常环境中时，能持续稳定地发出蓝绿光，其最大发射波长为485nm；然而，一旦遇到有毒有害物质，它的发光过程将受到强烈抑制，其抑制程度与所受的有毒有害物质的毒性及浓度有对应关系。例如，当遇到亚硝酸盐、亚砷酸盐、氨、重金属等时，它的发光过程会迅速被抑制。因此，青海弧菌q67是一种具有稳定发光和对外界有毒物质反应灵敏的淡水发光细菌，它在环境水质检测中具有重要应用价值。但是现有技术均是直接采用该发光菌的现场配制的悬液（工作菌液）进行毒性检测，现场人工配置、耗时较多，同时难以保证悬液中活性菌株的数量符合检测标准的要求。

7、在现有技术中，中国发明文献cn106525822a为克服现有毒理学急性联合毒性评价技术试验工作量大、定量评价与急性联合毒性作用预测方法缺失的问题，提供了一种预测三种农药对发光菌急性联合毒性的方法，但是，该方法并不能定性判断联合毒性性质(拮抗、独立、相加或协同)，必须通过建立基于三种农药浓度的发光菌相对发光抑制率模型，才能实现三种农药共同作用对发光菌急性联合毒性的定量预测，因此该方法仍然需要加以改进。

8、因此，直接将现有技术用于野外现场开展水质急性毒性测试，特别是对复合污染物进行发光菌的联合毒性效应的检测，还存在设备、菌液、检测过程耗时长、测试结果不稳定等技术上的不足与缺陷。现有技术中毒性测试的在线监测、便携式毒性分析仪等设备已有报道，主要涉及利用发光细菌制备的在线监测仪器、便携式水质综合毒性分析仪、生物毒性分析仪、基于水质监测的生物预警系统等技术，这些技术的共同特点均是：采用传统的化学发光酶标仪，利用冻干粉解冻现场配制的发光工作菌液，暴露在水样中，开展在线监测、急性毒性测试或综合毒性监测。但是，都存在着测试设备难以携带、待测水样需前处理、需要现场制备工作菌液，导致测试设备体积大（通常需要外置电源）、测试方法繁琐、耗时长、容易受到冻干粉质量及测试环境条件（温度、洁净度）等的影响，难以实现快速的野外环境下的现场联合毒性检测，并且难以确保实验结果不会受到工作菌液和前处理过程的影响等不足。

9、因此，上述现有技术所提供的水质急性毒性测试发光菌测试方法中，均是采用发光菌的悬液（工作菌液）直接暴露进行毒性检测，测试水样需前处理，测试设备需要外接电源，导致测试方法繁琐、设备难以携带和在野外条件下工作、无法实现在野外现场的快速联合毒性检测，而且其实验结果还容易受到前处理、冻干粉质量与菌液复溶过程等的影响，不能满足野外现场条件下快速开展水质联合急性毒性的批量化、快速检测，获得准确的结果，满足野外条件下水质毒性应急联合检测和机动检测，以及进行大范围的推广应用和普及的需求。

技术实现思路

1、针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于，提供一种野外水质现场检测的联合急性毒性测试方法，针对水样中复合污染物的联合毒性效应检测需要，通过预制发光细菌凝珠和便携手持式水质急性毒性检测仪的配合，大幅简化了检测准备、检测过程和检测仪器，从准备检材到获得检测结果、最快10分钟以内即可完成一个批次的水样检测，能够克服现有水质急性毒性测试发光菌法测试方法中测试设备无法携带、需要外部电源，水样需前处理，菌液需要现场制备等设备中、检材多、方法繁琐、无法实现野外现场条件下的快速、批量联合毒性检测的不足，以及菌剂复溶后的菌液中的活性菌株数量难以保证符合标准要求，实验结果容易受到前处理过程、活性菌株数量不稳定、操作人员人为等影响因素而不准确的不足，可满足大规模、大范围的推广应用和普及的需求。

2、本发明为解决上述问题而提供的技术方案为：

3、一种野外水质现场检测的联合急性毒性测试方法，其包括如下步骤：

4、s1：准备便携手持式水质急性毒性检测仪，该检测仪包括壳体及设置在壳体内的显示面板、生物发光光度计、检测仓，检测仓内设有检测孔板，检测孔板上设有多个检测孔；所述检测孔板上设置的每个检测孔的容积均为200 μl；

5、s2：预先批量制备多个发光菌凝胶珠，并且保证每个发光菌凝胶珠的包膜内具有满足检测标准要求的活性发光菌株的数量，冷冻保存；单个的发光菌凝胶珠的容积为50~60μl，发光菌凝胶珠的内容物中活性发光菌株的个数为平均不小于2×105；所述包膜的孔径为300~500nm，包膜内部的亲水性网状结构的孔径为500~800nm；

6、s3：将便携手持式水质急性毒性检测仪与冷冻的批量发光菌凝胶珠，携带至野外水质检测现场，并在现场采集或者制备待检测水样，待检测水样中包括至少两种分子直径不同的毒性物质（如分子直径不同的无机物类及有机物类毒性物质）；

7、s4：将冷冻的发光菌凝胶珠批量取出，在常温下自然解冻、使各个发光菌凝胶珠包膜内的发光菌恢复活性；

8、s5：将待检测水样分别注入到检测孔板中，然后向每个检测孔中放入一个发光菌凝胶珠，然后将检测孔板连同待检测水样、发光菌凝胶珠，一并放入水平状态的检测仓中；

9、s6：在30分钟内，待检测水样中的分子直径小的（如无机物类）毒性物质首先穿过包膜到达包膜内部、对发光菌株的荧光产生影响、形成第一个时间段内的荧光变化速率，其后分子直径大的（如无机物类）有机物类毒性物质也到达包膜内部，与先行到达的小分子直径的毒性物质相互作用，共同影响发光菌株、形成第二个时间段内的荧光变化速率；使用便携手持式水质急性毒性检测仪内的生物发光光度计，按照时间顺序，分别采集和记录各个检测孔内的发光菌株的荧光变化数据，计算后得到各个检测孔内的待检测目标物中一种毒性物质对发光菌凝胶珠内发光菌株的发光抑制速率，以及两种毒性物质共同对发光菌凝胶珠内发光菌株的发光抑制速率，由此得到两种毒性物质共同作用后的联合急性毒性数据，以及两种毒性物质的相互作用类型属于协同作用、相加作用或者拮抗作用中的何种；再分别计算得到各个检测孔内待检测目标物中对应的两种毒性物质的浓度数据，记录并通过显示面板输出，完成一个批次的野外条件下对水质快速检测的现场联合急性毒性测试，并且同时完成对两种毒性物质复合污染时的毒性效应类型的评价。

10、s7：完成一个批次的测试后，从检测仓内取出检测孔板，将完全检测的已检测水样、发光菌凝胶珠一并回收到指定的容器中，清空检测孔板；

11、s8：重复步骤s4-s7，完成后续批次的待检测水样的联合急性毒性检测，直至完成全部待检测水样的检测。

12、所述小分子直径的毒性物质包括无机物类的铬、汞、锌、铜、铅、镉、砷等重金属离子；所述的大分子直径的毒性物质包括有机物类的农药、抗生素类化合物、氯酚类化合物、苯酚类化合物、酞酸酯类化合物。

13、本发明提供的野外水质现场检测的联合急性毒性测试方法，与现有技术相比，其有益效果至少包括：

14、1、本发明提供的野外水质现场检测的联合急性毒性测试方法，是通过预制发光细菌凝珠和改进便携手持式水质急性毒性检测仪的结构，使二者密切配合，利用发光菌凝胶珠的包膜结构（对不同分子量大小的两类毒性物质的通透性不同），对复合污染物的二元联合急性毒性进行检测，并且能够检测出具体的二者联合作用类型；可以实现在野外环境条件下也能快速、高效、准确、批量的完成水样联合毒性检测，大幅简化了检测准备、检测过程和检测仪器，从准备检材到获得检测结果、最快10分钟以内即可完成一个批次的水样检测，仅为现有技术的20~30%。

15、2、本发明提供的野外水质现场检测的联合急性毒性测试方法，其改进了现有技术中的便携手持式水质急性毒性检测仪的结构，使用自带电源（电池），去除了无法支持定量定容的发光菌凝胶珠且操作复杂、检测时需要进行密闭的反应试管，更换为开放结构的多孔检测孔板（如18孔）、检测过程中也无需封闭（仅需保持水平放置），配合预先批量制备的发光菌凝胶珠，一孔一珠，使批量检测过程中的放入、检测、取出等操作非常便利，水样无需前处理，发光菌凝胶珠自然解冻即可使用，发光菌株的数量足够，而且不会混入野外环境下的杂菌，在简化操作步骤的同时，也提高了检测结果的稳定性和准确性。本发明通过不同毒性分子与发光菌凝胶珠之间的相互作用（透过性、渗透性）的差异，能在一次检测过程中，定性判断不同种类的毒性物质之间的联合毒性效应(拮抗、独立、相加或协同)，而无需建立基于农药等毒性物质浓度的发光菌相对发光抑制率模型，一次检测即可实现对多种毒性物质（农药或其他的有机物、与重金属等无机物）共同作用对发光菌急性联合毒性的定量预测，因此本发明该方法较现有技术具有较大的突破、操作简便而且扩展了可应用的联合毒性效应检测物质的范围，能够同时检测不同种类的有机物和无机物之间的联合毒性效应，而且是一次检测即可得到对应的毒性效应及定量浓度，大幅简化了检测操作步骤，节约了检测时间和检测耗材。

16、3、本发明提供的野外水质现场检测的联合急性毒性测试方法，采用在实验室条件下预先批量制备的发光菌凝胶珠，代替传统的现场配制的发光菌液（工作菌液），一方面能够保证包膜内具有满足标准要求的活性发光菌株的数量，另外还可以省去现场条件下的复溶、搅拌等环节，避免环境中的杂菌进入；第三，该发光菌凝胶珠为定容（50~60μl）、定量（活菌数量）设计，在制备时控制了每个发光菌凝胶珠的容积和内容活性发光菌株的数量、完全匹配检测孔的水样容积（200 μl）和检测标准的要求，在现场检测时，在每个检测孔中对应放入一个在自然解冻5分钟后、恢复至常温的独立的发光菌凝胶珠，凝胶珠中的发光菌株就可以恢复活性，在此后的30分钟内，向各检测孔注入含有待检测目标物的水样，由仪器自动观察待检测目标物对发光菌凝胶珠内发光菌株的发光抑制率，计算后即可得到待检测目标物的浓度，操作方便快捷，最快10分钟内就可以完成一个批次（采用18孔检测板时、一批次检测18个水样），而现有技术便携手持式水质急性毒性检测仪每批次只能检测3个水样、每批次耗时30分钟以上，因此本发明的批量检测效率是现有技术的10倍以上。

17、4、本发明提供的野外水质现场检测的联合急性毒性测试方法，针对现有技术中工作菌液及样品前处理等诸多不足，通过对发光细菌凝珠的组分、配比、结构及制备工艺的配合，采用固定化技术包埋发光菌、将符合要求数量的活性发光菌株包埋于特定材料内、形成特定容积的相互独立的发光菌凝胶珠，再将发光菌凝胶珠整体上冷冻、运输，用于野外条件下的水质样品的直接急性毒性测试，每个检测孔放置一个自然解冻的发光菌凝胶珠即可进行检测，水样无需前处理，较好的克服了现有水质急性毒性测试发光菌法测试方法中测试检材多、测试方法繁琐、无法适应野外现场检测环境，以及菌剂复溶后的菌液中的活性菌株数量难以保证符合标准要求，使实验结果容易受到外部因素影响而不稳定，外部因素包括前处理过程、菌株数量不稳定、操作人员人为等；通过标准化制备的发光细菌凝珠，与改进后的便携手持式水质急性毒性检测仪的相互配合，能够使其能够满足野外现场的环境条件，而且其操作方法简便、可以标准化，因而能够满足大规模、大范围的推广应用和普及的需求。

18、5、本发明重点是针对野外或者现场（非实验室条件下的）检测时，检材的快速、准确制备需求，通过对预制发光细菌凝珠的菌种、组分、配比、结构及制备工艺的配合，采用活性固定化技术包埋发光菌、将符合要求数量的活性发光菌株包埋于特定材料内、形成特定容积的相互独立的发光菌凝胶珠，再将发光菌凝胶珠整体上冷冻、运输，用于野外条件下的水质样品的直接急性毒性测试；根据每个检测孔的通常容积（200 μl）的检测需求，特别设计和制备大小适中、便携、复活后活菌浓度达标的发光菌凝胶珠；通过选择合适的发光菌株及成膜材料，将其批量、制备为成品，可以低温下保存、携带和运输，从而克服了现场用冷冻菌粉制备菌液，由于条件限制和人为操作等因素的影响，配置的测试菌浓度不准确，导致检测结果不准确等问题。

19、6、本发明制备的发光菌凝胶珠在实验室条件下可以批量制备、然后-4°c冷冻条件下保藏和运输，可以使发光菌株在凝胶珠内部持续保持活性；运输到检测现场后，自然解冻至常温、绝大多数发光菌株可自行恢复活性，因本发明在制备凝胶珠时综合考虑了每个凝胶珠中必须保证的有效菌个数和检测孔的容积，故将其设计为特定的容积、固定化了富余数量的菌株，在解冻后每个检测孔放置一粒凝胶珠，即可确保满足标准对发光菌浓度的要求，通常在此后的10-30分钟内完成检测即可。

20、7、本发明采用的发光菌凝胶珠，其包膜为海藻酸钙薄膜，该薄膜的孔隙的孔径合适能够使被测毒性物质的分子顺利穿过、快速渗透到凝胶珠的内部，进行测试，而同时能保证检测过程中该发光菌凝胶珠外形的完整，持续将发光菌株约束在内部。通过 sem（电子显微镜）扫描结果分析，海藻酸钙薄膜表面有明显的孔洞，孔径大小约为0.5μm；发光菌凝胶珠的内容物内部的结构为海藻酸钙与海藻酸钠混合填充的亲水性网状结构，均具有较大的孔径，待测的毒性检测目标物中无机物类的分子直径约为0.1~0.5nm，有机物类的分子直径约为100~220nm，均远小于薄膜及内容物的孔隙大小，因此可以穿过该包膜和内容物、顺利进入到发光菌凝胶珠内部，影响内部发光菌株的活性，完成检测；但是二者的穿过性和流动性不同，到达内部存在一定的时间差；该时间差导致的发光速率变化，能够应用于联合毒性效应分析。

21、8、本发明还充分考虑了发光菌凝胶珠内的发光菌发光过程与其细胞的活性和生理代谢活动的相关性，发光菌作为毒性受试生物，在一定的试验条件下发光菌的发光强度保持恒定，污染物毒性作用使其细胞的生理活性发生改变，导致生物发光强度的减弱，变化的程度与受试物浓度在一定范围内呈相关关系。因此本发明可以通过测定发光细菌凝珠中发光菌整体发光度的下降程度（荧光变化速率），评价被测物质毒性（或者联合毒性）的强弱程度。发光强度的变化可由发光光度计测出，费时较少且灵敏度高，操作简便，结果准确。

22、9、本发明实施例采用的青海弧菌是唯一的非致病型淡水发光菌，其冻干粉在运输、使用过程中安全可靠，废弃的菌液无需特殊处理，不会引起二次污染。本发明方法使用青海弧菌的一个变种青海弧菌q67（原始菌种由华东师范大学生命科学学院提供），作为水生生物毒性检测的指标生物具有快速简便灵敏度高的优点。本发明制备的凝胶小球，原料廉价易得，制备凝胶和培养菌种的条件较为简单，可以基于其设计出一种现场快速检测，水体样品污染物毒性的简易方法。本发明提供的固定青海弧菌q67的水质检测方法简便易行，实验使用的分析仪器及操作方法也较为简便，可用广泛应于非专业领域的定性检验。

23、10、经过实际测试，本发明采用预先制备的发光细菌凝珠与改进的便携手持式水质急性毒性检测仪，可以广泛应用于各种野外现场开展水质联合急性毒性测试，能够大幅减少检材种类和数量、简化测试方法，可实现现场批量检测，并且使检测结果避免受到水样前处理及菌液复溶等不确定性过程的影响，批量检测的过程快速、便捷，联合毒性检测的结果准确，突破了现有同类产品与技术的局限性，能够满足大规模、大范围、低成本的推广应用和普及的需求。