一种用于检测动脉粥样硬化性心血管疾病的3′端2′-O-甲基化修饰微小核糖核酸组合及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于检测动脉粥样硬化性心血管疾病3′端2′-o-甲基化修饰微小核糖核酸组合及其应用。

背景技术：

1、动脉粥样硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease，ascvd)是危害全球人类健康的主要原因之一。中国ascvd患病率处于持续上升阶段，死亡率占我国人口总死亡的40％以上，居各种疾病首位，高于肿瘤及其他疾病。现有评估ascvd发生风险的临床标志物存在各种局限性，如血脂常规检测无法针对急性事件给予有效预警，心肌标志物在心肌损伤后才出现异常，影像学检查技术经济成本高、不利于普检、筛查及监测。因此仍需寻找高灵敏性、特异性及临床应用价值更佳的ascvd标志物，以利于该病的风险评估、残余风险预防、预警及判别。

2、微小核糖核酸(microrna，mirna)是一类内源性、长度为19～22个核苷酸的单链非编码小分子rna，其可与下游靶蛋白基因信使rna(mrna)的3′端非翻译区互补结合，在基因转录后水平调控靶蛋白表达，进而在细胞、组织或个体水平上影响生物体的生长发育，并参与多种疾病过程。不同疾病患者外周血循环中存在特定变化的mirna谱，是一类极具临床应用潜能的疾病诊断生物学标记和治疗靶标。已有大量研究证实，ascvd患者循环mirna表达谱与对照具有明显差异，可作为ascvd患者危险分层、风险评估、病情监控及预后评估的潜在新指标。

3、近年来，rna表观遗传学修饰成为rna领域最新的研究热点，其中3′端最后一个核糖上的2′-oh位点的甲基化修饰，即3′端2′-o-甲基化(2′-o-methylation,2′ome)修饰是目前已知的mirna修饰最常见的形式之一，被修饰的mirna稳定性增强，并具有更强的生物学功能。大量研究证据表明，外周血中rna甲基化修饰水平测定在多种疾病诊断中具有极高的临床和转化应用价值，具备成为一类新的液体活检分子标志物潜能。探索ascvd患者外周血中的2′ome修饰水平，或可为ascvd这类复杂疾病的判别、病情监控及预后评估开辟一条新途径和新方法，具有重要的应用前景和意义。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测动脉粥样硬化性心血管疾病的3′端2′-o-甲基化修饰微小核糖核酸组合及其应用。基于所述标志物的检测方法能够无创、快速、精准地对ascvd进行辅助诊断检测，在ascvd筛查诊断研究中具有重要的应用价值。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种检测ascvd患者的3′端2′-o-甲基化修饰的microrna，所述3′端2′-o-甲基化修饰mirna选自hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-7d-3p、hsa-mir-486-5p和hsa-mir-423-3p或其组合。

4、本发明前期运用高碘酸钠(naio4)氧化处理结合小分子rna测序技术，对患者血清中2′-o-甲基化修饰mirna表达谱进行测定，在单样本血清水平，运用茎环pcr结合加尾pcr法验证测序结果，筛选ascvd患者血清中2′-o-甲基化修饰水平显著、稳定变化的一组mirna，再在样本血清中对筛选的mirna进行复筛和验证，获得得4种差异血清2′-o-甲基化修饰mirna标志物。

5、根据本发明筛选得到的与ascvd相关的2′-o-甲基化修饰microrna标志物为hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-7d-3p、hsa-mir-486-5p和hsa-mir-423-3p，其在至少一种靶血清中与在至少一种健康对照血清中差异表达，因此可以反映出在ascvd患者及健康者中的差异表达，体现了ascvd诊断的高敏感性和高特异性。

6、在具体的实施方案中，本发明所涉及的2′-o-甲基化修饰的mirna标志物的基因序列为，2′ome-mir-320a-3p对应的序列为seq id no:1；2′ome-mir-7d-3p对应的序列为seqid no:2；2′ome-mir-486-5p对应的序列为seq id no:3；2′ome-mir-423-3p对应的序列为seq id no:4。

7、第二方面，本发明提供检测血清3′端2′-o-甲基化修饰mirna的系统在制备筛查或辅助筛查、诊断或辅助诊断动脉粥样硬化性心血管疾病的产品中的应用，所述血清2′ome-microrna为2′ome-mir-320a-3p、2′ome-mir-7d-3p、2′ome-mir-486-5p和2′ome-mir-423-3p或其组合。

8、在具体的实施方案中，所述2′ome-mir-320a-3p的序列如seq id no.1所示的单链rna，2′ome-mir-7d-3p的序列如seq id no.2所示的单链rna，2′ome-mir-486-5p的序列如seq id no.3所示的单链rna，2′ome-mir-423-3p的序列如seq id no.4所示的单链rna。

9、在具体的实施方案中，所述检测3′端2′-o-甲基化修饰mirna的系统包括检测3′端2′-o-甲基化修饰mirna试剂和/或仪器。

10、在具体的实施方案中，所述产品包括系统，所述系统包括试剂和/或系统，所述试剂包括制剂或试剂盒。

11、第三方面，本发明提供一种用于筛查或辅助筛查、诊断或辅助诊断动脉粥样硬化性心血管疾病的试剂盒，其特征在于，含有检测3′端2′-o-甲基化修饰mirna的试剂，所述2′ome-microrna为2′ome-mir-320a-3p、2′ome-mir-7d-3p、2′ome-mir-486-5p和2′ome-mir-423-3p或其组合。

12、在具体的实施方案中，所述2′ome-mir-320a-3p的序列如seq id no.1所示的单链rna，2′ome-mir-7d-3p的序列如seq id no.2所示的单链rna，2′ome-mir-486-5p的序列如seq id no.3所示的单链rna，2′ome-mir-423-3p的序列如seq id no.4所示的单链rna。

13、在具体的实施方案中，所述试剂盒采用茎环法和加poly(a)尾法两种rt-qpcr技术检测血清3′端2′-o-甲基化修饰mirna表达水平变化。

14、在具体的实施方案中，采用茎环法为原理的rt-qpcr不能准确识别mirna的3′端2′-o-甲基化位点，而加poly(a)尾rt-qpcr因2′-o-甲基化位点显著抑制了poly(a)聚合酶活性，可以准确、可靠地测量检测血清3′端2′-o-甲基化修饰mirna修饰水平变化。

15、在具体的实施方案中，采用茎环法为原理的rt-qpcr中，逆转录酶不能准确识别mirna的3′端2′-o-甲基化位点，而加poly(a)尾rt-qpcr中，逆转录酶poly(a)聚合酶准确识别mirna的3′端2′-o-甲基化位点。

16、在具体的实施方案中，校准茎环法和加尾法的扩增效率后，分别逆转录等量的rna，加尾法荧光定量检测出现延迟扩增。

17、在具体的实施方案中，所述试剂盒还包括两种rt-qpcr检测试剂，分别为茎环法反转录试剂部分和荧光定量检测试剂部分，加尾法反转录试剂部分和荧光定量检测试剂。

18、优选的，所述茎环法反转录试剂部分包括无酶水、逆转录酶、dntps、逆转录酶缓冲液、rt-primer等组分。

19、优选的，所述茎环法荧光定量检测试剂部分包括无酶水、rtaq酶、10xbuffer(mg2+plus)、dntps、probe tm等组分。

20、优选的，所述加尾法反转录试剂部分包括无酶水、5x miscript hispec buffer、10x miscript nucleics mix、miscript reverse transcriptase mix等组分。

21、优选的，所述加尾法荧光定量检测试剂部分包括无酶水，quantitect sybr greenpcr master、10xmiscript universal primer、forward primer assay等组分。

22、第四方面，本发明提供一种筛查或辅助筛查、诊断或辅助诊断动脉粥样硬化性心血管疾病的系统，所述系统包括：

23、(1)样品扩增模块：提取待测样本的血清mirna，使用前文任一所述的试剂盒对目标microrna进行茎环法反转录，再进行实时荧光定量反应，检测荧光信号；对目标microrna进行加尾法反转录，再进行实时荧光定量反应，检测荧光信号；

24、(2)结果分析模块：以茎环pcr结合加尾pcr法产生的循环数(ct值)差值(δct值)的2δct值视为mirna 2′-o-甲基化修饰水平差异。

25、第五方面，本发明还保护前文所述的试剂盒、前文所述的系统在制备筛查或辅助筛查、诊断或辅助诊断动脉粥样硬化性心血管疾病的产品中的应用。

26、本发明的动脉粥样硬化性心血管疾病包括冠心病(急性冠脉综合征、稳定性冠心病、心力衰竭)、脑血管疾病(短暂性脑缺血发作、缺血性卒中、出血性脑卒中)及外周动脉疾病等。

27、本发明所涉及的2′-o-甲基化修饰的mirna标志物的基因序列为，2′ome-mir-320a-3p对应的序列为seq id no:1；2′ome-mir-7d-3p对应的序列为seq id no:2；2′ome-mir-486-5p对应的序列为seq id no:3；2′ome-mir-423-3p对应的序列为seq id no:4。

28、本发明的有益效果在于：本发明通过ascvd患者和健康对照组血清中2′-o-甲基化修饰的mirna的表达谱分析，发现57种mirna在ascvd患者血清中2′-o-甲基化修饰水平明显高于健康对照，进一步测试11种mirna是否和测序结果中甲基化修饰水平一致；发现4种2′-o-甲基化修饰的mirna可以作为分子标志物在ascvd的诊断试剂或试剂盒中进行临床应用。

29、继续通过实验研究得到这4种2′-o-甲基化修饰的mirna：2′ome-mir-320a-3p、2′ome-mir-7d-3p、2′ome-mir-486-5p和2′ome-mir-423-3p在ascvd患者血清中表达水平显著、稳定变化；roc曲线表明2′ome-mir-320a-3p、2′ome-mir-7d-3p、2′ome-mir-486-5p和2′ome-mir-423-3p可单独，也可以联合作为ascvd辅助鉴别的分子标志物，为ascvd的诊断和治疗提供多种新的应用方向。有研究报道mirna对疾病的提前诊断和发病预测都有很好的特异性和敏感性，且稳定性好，检测结果可靠。最新研究已证实人类肿瘤组织中mirna存在不同程度的2′-o-甲基化修饰，被修饰的mirna稳定性增强，并具有更强的生物学功能，具备成为一类新的风险评估和鉴别诊断的分子标志物潜能。本发明的标本为受试者外周血，样品标本易于获得，临床操作性强且对受试者属于无创伤性。