一种构建滑膜肉瘤转基因小鼠动物实验模型的方法

本发明属于实验动物模型构建，具体涉及一种自发性条件性滑膜肉瘤转基因小鼠动物模型的构建与应用。

背景技术：

1、滑膜肉瘤(synovial sarcoma，ss)是一种好发于儿童和青少年间叶组织来源的高度恶性软组织肿瘤(soft tissuesarcoma，sts)，是最常见的恶性软组织肿瘤之一。95％以上的滑膜肉瘤患者存在特征性染色体易位(x；18)(p11.2；q11.2)，即18号染色体上的ss18基因和x染色体上的ssx1、ssx2和ssx4形成融合基因。该疾病具有极高的局部复发率和远处转移率，虽然滑膜肉瘤的治疗方案包括手术治疗、放疗、化疗和靶向药物治疗等，但文献报道其转移率可高达50％，5年无转移生存率为40％-70％，在复发和转移患者中5年生存率低于20％，且在近年间无显著改善。近年研究发现，ss18-ssx基因融合产物是导致滑膜肉瘤发生发展的重要原因，但近几十年来针对病因的研究却一直未能取得有效成果。分析原因，与缺乏行之有效的模型来对ss18-ssx融合产物开展全面的机制研究不无关系。

2、crispr(clustered,regμlarlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒dna或其他外源dna的免疫机制。在细菌中，crispr系统共分成3类，其中i类和iii类需要多种crispr相关蛋白(cas蛋白)的参与而共同发挥作用，而ii类系统只需要一种cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前，来自streptococcus pyogenes的crispr/cas9系统应用最为广泛。cas9蛋白(含有两个核酸酶结构域，可以分别切割dna两条单链。cas9首先与crrna及tracrrna结合成复合物，然后通过pam序列结合并侵入dna，形成rna-dna复合结构，进而对目的dna双链进行切割，使dna双链断裂。由于pam序列结构简单(5’-ngg-3’)，几乎可以在所有的基因中都能找到大量靶点，因此得到广泛的应用。crispr/cas9技术已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑技术。通过基因工程手段对crrna和tracrrna进行改造，将其连接在一起得到grna(guide rna)。融合后的rna具有与野生型rna类似的活力，但因为结构得到了简化，更方便研究者使用。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是：如何构建一种自发可传代滑膜肉瘤转基因小鼠动物实验模型。

2、为解决上述技术问题，第一个方面本发明提供一种构建滑膜肉瘤转基因小鼠动物实验模型的方法，所述方法包括向小鼠中导入dna分子，得到含有所述dna分子的转基因目的小鼠，将所述转基因目的小鼠传代，得到滑膜肉瘤转基因小鼠动物实验模型；

3、所述dna分子含有syt-ssx2蛋白的编码基因，所述syt-ssx2蛋白为氨基酸序列是seq id no.1的蛋白质。

4、进一步地，所述的方法中，所述dna分子还包括荧光蛋白的编码基因。

5、进一步地，所述的方法中，所述荧光蛋白为氨基酸序列是seq id no.2的蛋白质。

6、进一步地，所述的方法中，所述dna分子的核苷酸序列是seq id no.3第2268-5728位。

7、在本发明的一个实施例中，所述dna分子的上游含有cre-lox重组系统，所述cre-lox重组系统的核苷酸序列是seq id no.3第1370-2258位。其中seq id no.3第1370-1403位为loxp，第1564-1698位、1818-1952位、第2072-2206位分别为polya signal基因，第2225-2258位为loxp。

8、进一步地，所述的方法中，所述滑膜肉瘤转基因小鼠动物实验模型中，所述编码基因的整合位点位于受体小鼠的rosa26基因(rosa26基因位点)。

9、进一步地，所述的方法中，所述蛋白质的整合位点位于小鼠rosa26基因的第一内含子(intron 1)。

10、进一步地，所述方法包括s1)和s2)

11、s1)、将cas9蛋白质、靶向rosa26基因的sgrna和含有权利要求1-3中所述的dna分子的重组载体注射到小鼠原核期受精卵中获得基因重组的受精卵细胞；

12、s2)、将s1)获得的基因重组的受精卵细胞移植到雌性受体小鼠的输卵管内，使所述基因重组的受精卵细胞在所述受体小鼠的子宫中发育，筛选鼠仔获得转基因目的小鼠。

13、进一步地，所述的方法中，所述方法还包括s3)或/和s4)

14、s3)、将s2)获得的转基因目的小鼠与野生型小鼠杂交，筛选获得转基因杂合体子代小鼠；

15、s4)、将s3)获得的杂合体子代小鼠中的雄性鼠和雌性鼠进行交配，筛选获得转基因杂合体或转基因纯合体子代小鼠；

16、s5)、将s4)获得的转基因杂合体或转基因纯合体子代小鼠与携带cre限制性内切酶的小鼠进行交配，筛选获得自发性条件性滑膜肉瘤转基因小鼠，或

17、在s4)获得的转基因杂合体或转基因纯合体子代小鼠的纤维结缔及肌肉组织内注射携带cre重组酶(如腺病毒载体cre，adeno-cre等)后获得自发性条件性滑膜肉瘤转基因小鼠。

18、进一步地，上述的方法中，s2)转基因目的小鼠的筛选方法包括如下步骤：

19、c1)、使用引物r26 gtf和r26 gtr以待测样本的cdna为模板进行pcr反应；

20、c2)、使用引物r26 gtf和t-pa sr-y以待测样本的cdna为模板进行pcr反应实验；

21、c3)、结果判断：c1)步骤扩增出215bp的目的条带且c2)步骤扩增出307bp的目的条带，则待测样本为转基因目的小鼠(转基因杂合体小鼠)；

22、其中上述各引物的核苷酸序列分别如下：

23、r26 gtf：5’-gagttctctgctgcctcctg-3’(seq id no.5)；

24、r26gtr：5’-ccgaaaatctgtgggaagtc-3’(seq id no.6)；

25、t-pa sr-y：5’-tgcaagcttctgatggaatt-3’(seq id no.7)。

26、进一步地，上述的方法中，s3)所述转基因杂合体子代小鼠和s4)所述转基因纯合体子代小鼠的筛选方法包括如下步骤：

27、d1)、pcr1实验：使用引物r26 gtf和r26 gtr以待测小鼠的cdna为模板进行pcr反应；

28、d2)、pcr2实验：使用引物r26 gtf和t-pa sr-y以待测小鼠的cdna为模板进行pcr反应实验；

29、d3)、结果判断：①d1)步骤中无条带扩增且d2)步骤扩增出307bp的目的条带，则待测样本为s4)所述转基因纯合体子代小鼠；②d1)步骤扩增出215bp的目的条带且d2)步骤扩增出307bp的目的条带，则待测样本为转基因杂合体小鼠。

30、其中上述各引物的核苷酸序列分别如下：

31、r26 gtf：5’-gagttctctgctgcctcctg-3’(seq id no.5)；

32、r26gtr：5’-ccgaaaatctgtgggaagtc-3’(seq id no.6)；

33、t-pa sr-y：5’-tgcaagcttctgatggaatt-3’(seq id no.7)。

34、进一步地，所述的方法中，s1)所述sgrna的靶标序列为seq id no.4第1-20位(5’-actggagttgcagatcacga-3’)。

35、进一步地，上述的方法中，s1)所述sgrna基因的核苷酸序列可为seq id no.4。

36、进一步地，上述的方法中，s1)所述cas9蛋白质购自pnb公司，其货号为cp01-50。

37、进一步地，上述的方法中，s1)所述原核期受精卵细胞可来源于c57bl/6小鼠。

38、进一步地，上述的方法中，s2)所述受体小鼠可为假孕cd1雌性小鼠。

39、进一步地，上述的方法中，s3)所述野生型小鼠可为c57bl/6j小鼠。

40、进一步地，上述方法中，s5)所述携带cre限制性内切酶的小鼠可为b6.129s4-myf5tm3(cre)sor/j小鼠。

41、进一步地，上述方法中，s5)所述纤维结缔及肌肉组织泛指源自间充质干细胞起源的小鼠组织，如小鼠上下肢体肌肉组织内。

42、进一步地，上述方法中，s5)所述筛选获得自发性条件性滑膜肉瘤转基因小鼠的方法可包括如下步骤：

43、e1)、pcr实验：使用引物common、wtr和mr为引物，剪取约10-14日龄子代小鼠尾，经氢氧化钠消化后，作为模板进行pcr实验。

44、引物序列如下：

45、引物common：5’-aac cag aga ctc ccc aag gt-3’(seq id no.8)；

46、引物wtr：5’-cgg ctc tta aag caa tgg tc-3’(seq id no.9)；

47、引物mr：5’-acg aag tta tta ggt ccc tcg ac-3’(seq id no.10)。

48、e2)、预期结果与分析

49、基因型鉴定的典型pcr产物示例与分析：

50、①野生型纯合子子代小鼠(wt/wt)：pcr实验结果为240bp单条带；

51、②杂合子转基因子代小鼠(myf5cre/wt)：实验结果为120bp和240bp两个条带；

52、③纯合子转基因子代小鼠(myf5cre/myf5cre)：pcr实验结果为120bp单条带。

53、为解决上述技术问题，第二个方面本发明提供上述的dna分子或/和与所述dna分子相关的生物材料，所述生物材料包括：

54、b1)、含有所述dna分子的表达盒；

55、b2)、含有所述dna分子的重组载体、或含有b1)所述表达盒的重组载体；

56、b3)含有所述dna分子的重组微生物、或含有b1)所述表达盒的重组微生物、或含有b2)所述重组载体的重组微生物；

57、b5)含有所述dna分子的细胞系、或含有b1)所述表达盒的细胞系、或含有b2)所述重组载体的细胞系。

58、进一步地，上述的生物材料中，b1)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述蛋白质的dna，该dna不但可包括启动上述蛋白质编码基因转录的启动子，还可包括终止上述蛋白质编码基因转录的终止子。

59、进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子和诱导型启动子。

60、上述的生物材料中，b2)所述重组载体可含有seq id no.3第2268-5728位所示的用于编码上述蛋白质的dna分子。

61、在本发明的一个实施例中，所述重组载体命名为rosa26-lsl-syt-ssx2-ires-tdtomato hrd，其核苷酸序列是seq id no.3。其中，seq id no.3第133-1188位为rosa265'arm，第1204-1307位为ad sa，第1370-1403位为loxp，第1564-1698位、1818-1952位、第2072-2206位分别为polya signal基因，第2225-2258位为loxp。第2268-3734位为syt-ssx2编码基因，第3735-4286位为ires，第4301-5728位为tdtomato编码基因。上述的生物材料中，b3)所述重组微生物具体可为病毒、细菌和真菌。

62、上述的生物材料中，b4)所述动物细胞系、可包括繁殖材料，也可不包括繁殖材料。

63、本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、病毒载体(如杆状病毒载体、逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒或疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)等)。

64、所述细胞系(宿主细胞)是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于：真核细胞(如酵母细胞、曲霉菌)、动物细胞(如哺乳动物细胞、昆虫细胞)或原核细胞。在本发明的一个实施例中，所述细胞系具体可为小鼠的受精卵细胞。

65、术语“细胞”和“细胞系”可互换使用，并且所有这类名称都包括其后代。

66、本发明提供一种自发性条件性滑膜肉瘤转基因小鼠动物模型。通过应用crispr/cas9技术，设计可高效识别rosa26的grna序列。使用slice同源重组连接方法，在国内外首次发明并构建了导致滑膜肉瘤发生发展的同源定向修复供体质粒(hrd)，将其命名为“rosa26-lsl-syt-ssx2-ires-tdtomato hrd”。将上述所有crispr成分混合并注射到c57bl6小鼠的受精卵中，然后将注射的受精卵转移到假孕cd1雌性小鼠中产仔。通过sangerdna测序筛选得到的后代，以确定正确f0代转基因小鼠。同时建立转基因小鼠的基因型鉴定pcr实验模型和反应体系，进行基因型鉴定，然后与野生型(wt)c57bl/6j小鼠进行交配，种系传递。在其后代中(f1和f2代)，应用基因型鉴定实验模型和体系进行基因型鉴定。通过与携带有限制性内切酶cre的小鼠交配，或局部应用含有cre的生物制剂，从而获得稳定传代的自发性条件性可视化滑膜肉瘤转基因小鼠模型。

67、本发明取得的有益技术效果如下：

68、1)本模型为自发性，即无需理化因素等外界刺激，小鼠即在固定年龄段内自发罹患滑膜肉瘤。rosa26定点整合位点位于小鼠6号染色体，为非编码基因。已被证明在大部分组织和细胞中都有表达。表达比较活跃的基因区域因为需要转录因子的进入基因组结构不会被异染色质化，因此在这个区域定点插入外源dna，在各组织中表达的可能性都非常高。所以，rosa26被用来作为外源基因表达的安全位点。本设计将syt-ssx2癌基因序列连接于rosa26定点整合位点后，确保syt-ssx2基因的表达。

69、2)该模型为条件性。本模型设计基于cre-lox重组系统，该系统具有操作简单、重组率高的优点，是体内遗传操作的强有力工具。利用cre-lox系统，可以在特定细胞、组织或整个生物体，甚至在特定时间点敲除或表达某个基因，实现对特定基因的时空特异性操作，这对基因功能的研究和人类疾病动物模型的建立都具有深刻影响。cre重组酶识别的回文dna位点，即loxp(locus of x-over p1)位点，长34bp，其特征结构为ataacttcgtata-nnntannn-tatacgaagttat。两边反向互补的13个碱基为cre重组酶的识别序列，中间的8个碱基为重组发生位置，这也决定了loxp的方向。n表示可变碱基，这些突变lox位点也能被cre重组酶识别，发生dna切割，根据loxp决定重组方式。本发明中，在rosa26下游，设计了“loxp-stop-loxp”序列，”stop”序列为“3×polya”。这样，在没有cre重组酶作用时，下游的”stop”序列表达，终止转录。而当cre重组酶存在时，特异性识别“loxp-stop-loxp”序列，实现”stop”序列的特异性切除，从而表达下游syt-ssx2序列。最终实现syt-ssx2癌基因的条件性表达和调控。

70、3)该模型具有可视化特征。即无论在体内或体外，在荧光设备激发下，该肿瘤组织和细胞显示红色荧光。肿瘤定位与示踪一直是肿瘤研究领域的重大课题，其中，荧光蛋白(fluorescent protein)是最佳选择之一。tdtomato为一种红色荧光蛋白，具有良好的光稳定性，亮度强于mcherry，是追踪表达水平的理想选择。可使用波长约为554nm的激发光(如绿光：520nm)进行激发，其最大发射波长为581nm。在本发明中，在tdtomato前方设计了内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,ires)，从而确保tdtomato的表达。