靶向KRAS蛋白G12D突变体的共价抑制剂

本发明涉及ras抑制剂，尤其涉及一种靶向kras蛋白g12d突变体的共价抑制剂及制备方法与应用。

背景技术：

1、ras（rat sarcoma，大鼠肉瘤）基因是一种重要的致癌基因，其突变存在于约30%的人类肿瘤中。kras（kirsten rat sarcoma viral oncogene，大鼠肉瘤病毒癌基因）是ras的三个亚型之一，且相比于其他两种ras亚型更易出现突变。kras是一类常见的致癌基因，至少参与了所有人类癌症的五分之一。尽管其在癌症治疗中有着重要作用，但是至今没有fda批准的可用于治疗kras突变癌症的有效药物，在早期研究中，由于ras蛋白大体为球形结构域，表面没有显著的较深的疏水口袋，难以结合小分子，而ras与三磷酸鸟苷（gtp）的亲和力又极强，难以发展竞争性活性口袋抑制剂，所以ras一度被认为是“不可成药”的蛋白质。

2、绝大多数的ras致癌突变集中在gly12、gly13、gln61这三个氨基酸残基上。其中，kras g12d占所有kras突变驱动的癌症的41%，是发生概率最大的癌变类型。如图1所示，g12c和g12d分别表示ras第12位的甘氨酸（g）突变为半胱氨酸（c）和天冬氨酸（d），这些突变都能使突变体在持续的gtp结合状态下积累，打破了ras-gtp与ras-gdp之间的平衡，使得ras激活状态占优，无视上游信号的持续导致细胞内ras下游信号过度激活，最终导致癌症发生。

3、虽然kras g12c和g12d的蛋白结构较为接近，但由于其突变位点氨基酸侧链巯基较强的亲核性，使得kras g12c相比其他突变更容易收到共价攻击，也更容易开发出与之结合的抑制剂。

4、kras g12c共价抑制剂最早是2013年发现的，在480个化合物中筛选出了两个先导物，显示出对突变kras g12c的修饰程度最大，被命名为6h05和2e07。随后通过对6h05的构效关系进行研究，进一步优化确定了两个有效的化合物（图 2），这些化合物被称为6h05系列。6h05系列的化合物与kras g12c结合，发现了一个被称为switch-ii pocket（s-ii p）的新结合位点。晶体结构显示，s-ii p位于kras中央的β折叠和switch-ii（sw2）之间，是通过抑制剂结合并诱导sw2重新排列而形成的。结果证明6h05系列让kras g12c共价抑制剂的尝试获得了首次成功。而s-ii p的发现意味着kras蛋白中有了额外的结合位点，成为了后来药物设计的一个关键点。

5、kras g12c共价抑制剂发展进程中的另一个突破是喹唑啉系列化合物的发现。研究者设计了一组喹唑啉化合物能够结合在s-ii p空腔中，并在此基础上进一步的进行结构优化（图3）。结果表明，酰胺取代基的加入能够提高药物活性：除了增强抗增殖能力和诱导凋亡能力以外，酰胺基的修饰还增强了对kras g12c癌细胞的选择性。s-ii p的发现以及喹唑啉结构的发现与优化，为后续kras g12c抑制剂的发展奠定了坚实的基础。

6、基于这些发现，此后ars 1620、amg 510等针对kras g12c的共价抑制剂进行开发和上市（图3），这些上市药物的结构都未改变可以特异共价结合突变氨基酸位点的丙烯酰，只是在喹唑啉结的基础上进行优化改良，让新开发的抑制剂在低剂量的情况下就可以达到高的治疗效果。但如果缺乏丙烯酰胺的共价弹头只保留喹唑啉的结构，这些抑制剂是无法发挥共价抑制的功能，因此弹头的选择对药物的疗效是至关重要的。

7、近年来发展的靶向kras g12c突变体的小分子抑制剂在临床试验中效果显著，但含有kras g12c突变的病人只占kras突变病人总数的一小部分。为了解决kras g12d这一占比最大的癌症突变，有研究者在已经上市kras g12c抑制剂的基础上不断优化，开发出了通过盐桥可以靶向kras g12d的非共价抑制剂mrtx 1133（图4）。mrtx 1133是利用了之前krasg12c抑制剂的母核骨架去除了弹头，通过盐桥与g12d形成相互作用从而产生抑制功能，然而这种相互作用不是共价连接，存在着一定的脱靶副反应现象。

8、因此，现有技术仍有待于改进和发展。

技术实现思路

1、鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种靶向kras蛋白g12d突变体的共价抑制剂及制备方法与应用，旨在解决现有靶向kras g12d非共价抑制剂存在脱靶副反应的问题。

2、本发明提供了一款特异性针对kras g12d的共价抑制剂。具体根据卤代烷可以对天冬氨酸（asp）进行亲核攻击这一特性，开发靶向g12d的共价抑制剂。但是，与天冬氨酸残基侧链羧酸反应的官能团不能太活泼，否则会与其他无关位点反应，无法到达或是准确靶向靶标；设计的官能团同时反应性也不能太弱。因此，本发明设计了和羧基具有一定的反应性，但反应性较弱的官能团。最终，将该官能团确定为烷基卤素（作为弹头）。

3、本发明在kras g12c的共价抑制剂结构的基础上，对弹头进行改变。具体利用krasg12c的共价抑制剂的母核，将弹头改为烷基卤素，如此可以与kras g12d中的12位的asp发生共价的结合，进而对kras g12d蛋白持续激活的状态锁定，让蛋白失去活性和非活性之间转换功能，最后利用细胞内部自身的sos1等蛋白来水解kras g12d处在活性状态下的atp，使得kras g12d蛋白最终处在非活性状态，让下游持续激活的信号通路关闭，抑制癌细胞的增殖。

4、本发明的技术方案如下：

5、本发明的第一方面，提供一种靶向kras蛋白g12d突变体的共价抑制剂，所述共价抑制剂具有如下结构中的一种或两种：

6、。

7、本发明的一种靶向kras蛋白g12d突变体的共价抑制剂，其烷基卤素弹头能共价靶向天冬氨酸，与kras g12d中的12位的asp发生共价的结合，进而对kras g12d蛋白持续激活的状态锁定，让蛋白失去活性和非活性之间转换功能，最后利用细胞内部自身的sos1等蛋白来水解kras g12d处在活性状态下的atp，使得kras g12d蛋白最终处在非活性状态，让下游持续激活的信号通路关闭，抑制癌细胞的增殖。

8、因此，本发明提供的共价抑制剂对kras蛋白g12d突变具有较好的抑制作用，可以用于治疗kras 蛋白g12d突变介导的疾病。

9、本发明的第二方面，提供一种靶向kras蛋白g12d突变体的共价抑制剂，所述共价抑制剂具有如下通式所示的结构中的一种或多种：

10、，

11、其中：m=0、1或2；n=0、1、2或3；r1=h、cl、乙炔基或乙基；r2=h或f；r3=h、oh或f；x=cl、br或i。

12、本发明的一种靶向kras蛋白g12d突变体的共价抑制剂，其烷基卤素弹头能共价靶向天冬氨酸，与kras g12d中的12位的asp发生共价的结合，进而对kras g12d蛋白持续激活的状态锁定，让蛋白失去活性和非活性之间转换功能，最后利用细胞内部自身的sos1等蛋白来水解kras g12d处在活性状态下的atp，使得kras g12d蛋白最终处在非活性状态，让下游持续激活的信号通路关闭，抑制癌细胞的增殖。

13、因此，本发明提供的共价抑制剂对kras蛋白g12d突变具有较好的抑制作用，可以用于治疗kras 蛋白g12d突变介导的疾病。

14、可选地，所述共价抑制剂选自以下结构中的一种或多种：

15、。

16、可选地，所述共价抑制剂选自以下结构中的一种或多种：

17、。

18、本发明提供的靶向kras蛋白g12d突变体的共价抑制剂均含有烷基卤素弹头，通过该烷基卤素弹头与突变位点的天冬氨酸共价结合，实现靶向kras g12d蛋白，使kras g12d蛋白处在非活性状态，抑制癌细胞的增殖。

19、本发明的第三方面，提供一种靶向kras蛋白g12d突变体的共价抑制剂的制备方法，其中，反应路线如下所示：

20、。

21、本发明的第四方面，提供一种靶向kras蛋白g12d突变体的共价抑制剂的制备方法，其中，包括步骤：

22、将原料1和三氟乙醇反应，得到化合物1；

23、将所述化合物1和原料2反应，得到化合物2；

24、将所述化合物2和原料3反应，得到通式2所示的共价抑制剂；

25、上述反应路线如下所示：

26、。

27、可选地，所述的靶向kras蛋白g12d突变体的共价抑制剂的制备方法具体包括步骤：

28、将原料1、三氟乙醇、碱和第一溶剂（如丙酮等）混合，在-60-0℃下反应1-8小时，随后升温至室温，反应结束后进行产物的纯化，得到化合物1；

29、将所述化合物1、原料2、碱、分子筛和第二溶剂（如1，4二氧六环或丙酮等极性溶剂）混合，在50-100℃加热条件下反应6-24小时，反应结束后进行产物的纯化，得到化合物2；

30、将所述化合物2和原料3和第三溶剂（如四氢呋喃等）混合，随后加入钯催化剂（如四（三苯基膦）钯）和碱，在50-100℃加热条件下反应6-24小时，反应结束后进行产物的纯化，得到通式2所示的共价抑制剂。

31、可选地，所述碱可以为碳酸钾、二异丙基乙基胺或三乙胺等不限于此。

32、可选地，所述的靶向kras蛋白g12d突变体的共价抑制剂的制备方法具体包括步骤：

33、将原料1、三氟乙醇、碳酸钾和和丙酮混合，在-40℃反应2小时，随后逐步升温至室温，反应结束后利用硅胶柱进行产物的分离纯化，得到化合物1；

34、将所述化合物1、原料2、二异丙基乙基胺、4a分子筛和1，4二氧六环溶剂混合，在65℃反应12小时，反应结束后利用硅胶柱进行产物的分离纯化，得到化合物2；

35、将所述化合物2和原料3混合，用四氢呋喃溶解，随后加入四（三苯基膦）钯（属于钯催化剂）和碳酸钾，在75℃反应12小时，反应结束后利用硅胶柱进行产物的分离纯化，得到通式2所示的共价抑制剂；

36、上述反应路线如下所示：

37、。

38、本发明的第五方面，提供一种靶向kras蛋白g12d突变体的共价抑制剂的制备方法，其中，包括步骤：

39、将原料1和三氟乙醇反应，得到化合物1；

40、将所述化合物1和原料2反应，得到化合物2；

41、将所述化合物2和原料3反应，得到通式2所示的共价抑制剂；

42、将所述通式2和原料4反应，得到通式1所示的共价抑制剂；

43、上述反应路线如下所示：

44、；

45、其中：m= 0、1或2；n= 0、1、2或3；r1=h、cl、乙炔基或乙基；r2= h或f；r3= h、oh或f；x= cl、br或i。

46、可选地，所述的靶向kras蛋白g12d突变体的共价抑制剂的制备方法，具体包括步骤：

47、将原料1、三氟乙醇、碱和第一溶剂（如丙酮等）混合，在-60 - 0℃下反应1-8小时，随后逐步升温至室温，反应结束后进行产物的纯化，得到化合物1；

48、将所述化合物1、原料2、碱、分子筛和第二溶剂（如1，4二氧六环或丙酮等极性溶剂）混合，在50-100℃加热条件下反应6-24小时，反应结束后进行产物的纯化，得到化合物2；

49、将所述化合物2、原料3和第三溶剂（如四氢呋喃等）混合，随后加入钯催化剂和碱，在50-100℃加热条件下反应6-24小时，反应结束后进行产物的纯化，得到通式2所示的共价抑制剂；

50、将所述通式2所示的共价抑制剂、原料4、碱和第二溶剂混合，在50-100℃加热条件下反应2-12小时，反应结束后进行产物的纯化，得到通式1所示的共价抑制剂。

51、可选地，所述的靶向kras蛋白g12d突变体的共价抑制剂的制备方法，具体包括步骤：

52、将原料1、三氟乙醇、碳酸钾和和丙酮混合，在-40℃反应2小时，随后逐步升温至室温，反应结束后利用硅胶柱进行产物的分离纯化，得到化合物1；

53、将所述化合物1、原料2、二异丙基乙基胺、4a分子筛和1，4二氧六环溶剂混合，在65℃反应12小时，反应结束后利用硅胶柱进行产物的分离纯化，得到化合物2；

54、将所述化合物2和原料3混合，用四氢呋喃溶解，随后加入四（三苯基膦）钯和碳酸钾，在75℃反应12小时，反应结束后利用硅胶柱进行产物的分离纯化，得到通式2所示的共价抑制剂；

55、将所述通式2所示的共价抑制剂、原料4、二异丙基乙基胺和1，4二氧六环溶剂混合，在80℃反应12小时，反应结束后利用硅胶柱进行产物的分离纯化，得到通式1所示的共价抑制剂；

56、上述反应路线如下所示：

57、。

58、本发明的第六方面，提供一种本发明所述的靶向kras蛋白g12d突变体的共价抑制剂在制备用于治疗癌症的药物中的应用。