一种基于改良PYG的肠道菌株筛选培养基及制备方法与流程

本发明涉及微生物筛选的，尤其涉及双歧杆菌属益生菌分离培养基及制备方法和应用，具体是一种基于改良pyg的肠道菌株筛选培养基及制备方法。

背景技术：

1、肠道是人体最大的消化器官，在健康的成年人中，消化道的菌种主要分布在大肠、盲肠和结肠段，形成一个复杂和动态的生态系统.人体肠道拥有微生物数量及种群是最多的，肠道中含有1000-1150种约100万株细菌，大约是人体细胞数量的10倍左右。它被定植并不断接触到各种微生物，包括双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌和假单胞菌等。

2、其中双歧杆菌是成人肠道中占绝对优势的正常寄宿菌。在伯杰细菌鉴定手册中，将基于16s rdna测序技术得到的双歧杆菌共分成了34个不同的种，包括青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌(长双歧杆菌婴儿亚种)、乳双歧杆菌(动物双歧乳脂亚种)、长双歧杆菌、假小链双歧杆菌以及嗜热双歧杆菌和嗜酸热双歧杆菌等。双歧杆菌具有多种益生功能如：改善免疫系统紊乱导致的肠道疾病，维持肠道菌群平衡；清除自由基缓解机体的氧化损伤，延缓衰老；分泌β-半乳糖苷酶，缓解乳糖不耐；抑制腐败菌生长和分解致癌物质达到抗癌(如结肠癌)的目的；降低血清胆固醇，防止动脉粥样硬化；减轻因肿瘤坏死因子tnf-α和脂多糖引起的炎症反应；提高2型糖尿病患者血清钙离子浓度并降低谷丙转氨酶的水平等。双歧杆菌作为益生菌被添加到乳制品中已经有多年历史，发酵乳也是双歧杆菌应用最广泛、最成熟的产品。由于人源肠道微生物菌株资源的匮乏，极大的限制了肠道微生物的应用与研究。基础的pyg培养基更易筛选获得占比高的弗氏埃希氏菌属和弗氏志贺氏菌属等有害菌株，对人体肠道的益生菌较难筛选获得。双歧杆菌属益生菌在产品中的应用多，但缺少筛选的培养基，特别是在pyg培养基基础上的，因此，亟需改进。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明的首要目的是提供一种基于改良pyg的肠道菌株筛选培养基及制备方法，该培养基及制备方法以pyg培养基为基础，加入高纯果胶、半乳糖、葡萄糖冲剂、可溶性淀粉，促进菌株生长，得到的一种分离培养基，提高了双歧杆菌属益生菌的分离种类和数量，提高了双歧杆菌属分离的菌株数量。

2、本发明的另一个目的是提供一种基于改良pyg的肠道菌株筛选培养基及制备方法，该培养基为能够补pyg培养基筛选过程中出现大量弗氏埃希氏菌属和弗氏志贺氏菌属等有害肠道菌株，难以筛选获得对人体健康有益的肠道潜在功能的缺陷，基本筛选不到弗氏埃希氏菌、弗氏志贺氏菌属等有害肠道菌株。

3、为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

4、一种基于改良pyg的肠道菌株筛选培养基，所述改良pyg的肠道菌株筛选培养基按浓度进行表示，包括以下组分：

5、溶液1：

6、

7、

8、溶液2：

9、

10、进一步，所述改良pyg的肠道菌株筛选培养基还包括有溶液3：

11、③硫酸庆大霉素 200-400μl/l

12、④氨苄卡西林钠 200-400μl/l。

13、其中，本发明的培养基由原始pyg培养基加溶液2中四种不同组分组成，可溶性淀粉、果胶、半乳糖和葡萄糖冲剂；其中可溶性淀粉有研究说明是由淀粉经过氧化剂、酸、甘油、酶或其他方法处理而成的淀粉衍生物，可以作为微生物的生长提供碳源、氮源、维生素和生长因子；果胶是一种水果蔬菜中发现的复杂的膳食纤维和益生元，研究表明水果中纤维的消耗与健康成人肠道中大量的果胶分解细菌属密切相关；半乳糖可选择性地促进人体肠道内固有的双歧杆菌等有益菌的增殖，从而起到辅助调节肠道菌群功效；在原始pyg培养基的基础上增加葡萄糖浓度，是因为葡萄糖不仅含有各种植物化学物质也是膳食纤维的良好来源，能够提供能量、供能，而且还能作为碳源、氮源和生长因子来使用，维持肠道菌株的丰度，对肠道菌株分离具有一定作用。综上，由四种组分与原始pyg培养基相结合，形成改良pyg培养基，提高培养基中碳源、氮源浓度，微生物和生长因子，促进双歧杆菌增殖，提高筛选获得双歧杆菌概率。

14、其中，原始pyg培养基按浓度进行表示，包括有溶液1、溶液2及固体培养基，具体包括以下组分：

15、溶液1：

16、

17、溶液2：

18、①0.1％维生素k1 400μl

19、②氯化血红素溶液(5mg/ml)5ml

20、ph值 5.9-6.1

21、固体培养基琼脂 15.00-16.00g/l。

22、其中，原始pyg培养基配制步骤为：首先称取0.008g左右的氯化钙放入装有200ml超纯水的玻璃烧杯中并充分溶解，然后把溶液2中的各组分分别溶于氯化钙溶液中备用。称取溶液1中的各组分与1.5l烧杯中备用。将各组分溶液混匀并调节ph到5.9-6.1，然后定容到1l；若配置固体培养基需再分别称取7.5g琼脂于1l锥形瓶中，并加入500ml定容后的培养液，于高压灭菌锅中121℃，20min灭菌，若配置液体培养基无需加琼脂。灭菌后冷却到50℃后每500ml培养基加入溶液2，混匀倒平板或分装到蓝口瓶中备用。

23、本发明所实现的基于改良pyg的肠道菌株筛选培养基的制备方法，包括以下步骤：

24、步骤(1)，配置改良pyg培养基；根据上述组分进行改良pyg培养基的配制培养液；若配置固体培养基需再分别称取琼脂于，并加入培养液，于高压灭菌锅中灭菌，若配置液体培养基无需加琼脂；

25、进一步，灭菌后冷却，再向培养液中加入溶液3，混匀倒平板或分装到蓝口瓶中备用。

26、根据上述组分进行改良pyg培养基的配制并定容培养液到1l；若配置固体培养基需再分别称取7.5g琼脂于1l锥形瓶中，并加入500ml定容后的培养液，于高压灭菌锅中121℃，20min灭菌，若配置液体培养基无需加琼脂；灭菌后冷却到50℃后每500ml培养液加入溶液3，混匀倒平板或分装到蓝口瓶中备用。

27、步骤(2)样本获取和预处理：由健康人体提供粪便样本；对获取的新鲜粪便样本进行16s扩增子高通量测序，通过生物信息分析粪便样本的菌群丰富度；

28、步骤(3)高通量富集培养：将步骤(2)预处理过后的人体粪便样本梯度稀释，利用流式细胞仪进行活菌检测并根据结果进行极限稀释，然后进行高通量筛选富集培养48h-72h；

29、步骤(4)菌种鉴定：挑取步骤(3)中培养获得菌液，进行提取dna，pcr扩增16s基因序列，加入改良pyg培养基并放入厌氧培养箱继续培养，检查测序的峰图质量，并通ez网站进行序列比对，将比对结果汇总整理；

30、进一步，加入改良pyg培养基900μl并放入厌氧培养箱继续培养，检查测序的峰图质量，并通ez网站进行序列比对，将比对结果汇总整理；

31、步骤(5)菌种保藏：

32、根据步骤(4)比对所得菌种鉴定结果，筛选需要保藏的菌株编号，按照对应编号保藏步骤(4)中所述96深孔板培养的菌液，并使用平板划线验证菌株是否污染。

33、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

34、经实验验证，本发明实现的改良pyg培养基较原始pyg培养基筛选获得弗氏埃希氏菌和弗氏志贺氏菌的几率从55.18％下降到0％左右。

35、经实验验证，本发明实现的改良pyg培养基较pyg培养基筛选获得双歧杆菌属的几率从1.72％上升到77.78％左右。

36、本发明实现的改良pyg培养基在原始pyg培养基基础上改进而成，配制简单，不易染菌。

37、本发明实现的改良pyg培养基易于筛选对人体健康有益的潜在功能菌株，同时，基本筛选不到弗氏埃希氏菌、弗氏志贺氏菌属等有害肠道菌株，为微生态药物的开发提供丰富的菌种资源。