一种发酵粘液乳杆菌FUA033及其应用

本发明属于生物工程，具体涉及一种发酵粘液乳杆菌fua033及其应用。

背景技术：

1、肌肉衰退引起的机体功能障碍增加老年人衰弱、跌倒、骨折与失能风险，严重损害老年人的健康和生活质量。遗憾的是，目前缓解肌肉衰退的显著有效手段缺乏。因此，显著有效地延缓老年人肌肉衰退已成为当前刻不容缓的重大课题。

2、尿石素a(urolithin a，ua)是由肠道菌群转化鞣花酸而产生的一种代谢物。2005年正式发现并命名尿石素a为鞣花酸(ellagic acid，ea)的代谢物，其分子式为c13h8o4，相对分子质量为228.2。尿石素a的生物学活性如下：增加骨骼肌线粒体的自噬及代谢相关蛋白的表达，从而改善中年人的肌肉质量、运动表现及线粒体健康，减缓肌肉衰退；在炎症条件下会增强细胞自噬以增强细胞活力，改善线粒体功能，抑制衰老；通过其抗菌、抗炎及抗氧化活性对炎症性肠病和结直肠癌发挥一定的治疗作用，可通过改善炎症促进紧密连接蛋白的生成改善肠道屏障功能，阻止毒素产生减轻伪膜性结肠炎诱导的结肠炎；诱导线粒体自噬减弱听觉细胞的衰老、扩增具有卓越抗肿瘤免疫力的记忆t细胞、预防帕金森病和阿尔兹海默症。

3、尿石素a具有如此多的生物活性，但前体鞣花酸向尿石素a的转化并不发生在所有个体中。基于肠道微生物代谢鞣花酸形成终产物尿石素的类型，可将个体分为不同的尿石素代谢型：终产物只有尿石素a的尿石素代谢a型；除了尿石素a之外还产生异尿石素a或尿石素b的尿石素代谢b型；无尿石素产生或产生量未达到检测量的尿石素代谢0型。但这种转化会随着个体的年龄，健康状况和饮食摄入量而变化。随着年龄的增加，尿石素代谢a型逐渐下降。超过40％的31岁以上人群的肠道微生物不具有该代谢能力。因此，2018年，美国食品药品监督管理局批准尿石素a为营养补充剂。2021年，amazentis开发了化工合成尿石素a为抵抗肌肉衰退营养补充剂商品mitopure。

4、相比于化学合成法，生物合成法便显得更为经济且对环境更为友好。开发高效转化鞣花酸生成尿石素a的益生菌，既可发酵制备尿石素a，又可开发富含尿石素a的食品，让老年人在体验美食的同时缓解相关疾病。目前，体外发酵转化鞣花酸生成尿石素a的菌株鲜有报道，本发明筛选获得了属于“一般公认安全”的菌株发酵粘液乳杆菌(limosilactobacillus fermentum)，并研究获得了利用该菌株转化鞣花酸生成尿石素a的方法。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供一种发酵粘液乳杆菌fua033及其应用。

2、本发明的技术方案如下：一种发酵粘液乳杆菌(limosilactobacillusfermentum)fua033，该菌株已经于2023年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.28447，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，联系电话为010-64807850。

3、本发明提供的发酵粘液乳杆菌fua033的筛选方法为：

4、1)样品采集：选取20名无抽烟酗酒史、近两个月内未服用抗生素等药品史、无胃肠道疾病史的健康成人志愿者(年龄：22-27岁)，按照要求志愿者连续两周每日食用生核桃0.7g核桃/kg体重，并在此期间保持健康饮食作息，两周后采集粪便样本；

5、2)富集培养：取粪便样本接种于添加有鞣花酸的液体培养基中进行富集培养；

6、3)稀释涂布：取步骤2)中的富集培养液用无菌生理盐水进行梯度稀释，涂布于固体培养基。

7、4)复筛：挑取平板上形态、大小、颜色、透明度、黏度等不同的单菌落到含有鞣花酸底物的发酵培养基中进行培养；

8、5)hplc检测与lc-ms/ms检测：高效液相色谱法和质谱法相结合筛选出可以转化鞣花酸生成尿石素a的菌株。

9、所述步骤1)和2)中的固体培养基与液体培养基均为wilkins-chalgren anaerobebroth(g/l)：胰酪蛋白胨10.0，氯化钠5.0，蛋白胨10.0，l-精氨酸1.0，葡萄糖1.0，酵母浸粉5.0，丙酮酸钠1.0，氯化血红素0.005，维生素k10.0005，ph7.1±0.1(25℃)。

10、所述步骤2)中的富集培养条件为在37℃厌氧工作站内培养72h，所述厌氧工作站内气体组成成分体积比为n2:h2:co2＝80:10:10。

11、所述步骤3)中的培养条件为37℃厌氧工作站内培养48h。

12、所述步骤3)中涂布接种量为50μl。

13、所述步骤4)中的培养条件为37℃厌氧工作站内培养48h。

14、另一方面，本发明提供了用所述发酵粘液乳杆菌fua033发酵制备尿石素a的方法，包括以下步骤：

15、1)菌种活化：将保种于-80℃冰箱中的发酵粘液乳杆菌fua033经平板划线活化；

16、2)种子培养：挑取活化后的单菌落接入到种子培养基中培养获得种子液；

17、3)发酵培养：将种子液接种于添加有鞣花酸的发酵培养基中进行发酵培养；

18、4)分离提取：将发酵液离心，所得上清液即为尿石素a粗提取液。

19、所述步骤2)中的种子培养基为wilkins-chalgren anaerobe broth(g/l)：胰酪蛋白胨10.0，氯化钠5.0，蛋白胨10.0，l-精氨酸1.0，葡萄糖1.0，酵母浸粉5.0，丙酮酸钠1.0，氯化血红素0.005，维生素k1 0.0005，ph7.1±0.1(25℃)。

20、所述步骤2)中的种子培养条件为37℃厌氧工作站内培养24h。

21、所述步骤3)中的发酵培养基为wilkins-chalgren anaerobe broth(g/l)：胰酪蛋白胨10.0，氯化钠5.0，蛋白胨10.0，l-精氨酸1.0，葡萄糖1.0，酵母浸粉5.0，丙酮酸钠1.0，氯化血红素0.005，维生素k1 0.0005，ph7.1±0.1(25℃)

22、所述步骤3)中的种子液的接种量为2％。

23、所述步骤3)中的发酵培养条件为在37℃厌氧工作站内培养48h。

24、所述步骤4)中的离心条件为在12,000×g、4℃离心10min。

25、本发明提供了一种发酵菌剂，其特征在于，所述发酵菌剂包含上述的发酵粘液乳杆菌fua033。

26、本发明提供的发酵粘液乳杆菌fua033或发酵菌剂用于发酵生产尿石素a。

27、本发明提供的发酵粘液乳杆菌fua033用于发酵生产蛋白酶和脂肪酶。

28、本发明提供了一种抑菌制剂，所述抑菌制剂包括上述发酵粘液乳杆菌fua033，所述抑菌为抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酿酒酵母和黑曲霉。

29、本发明提供了一种益生菌制剂，所述益生菌制剂包含上述发酵粘液乳杆菌fua033，所述益生菌制剂用于改善肠道菌群。

30、本发明的有益效果：本发明公开了一株发酵粘液乳杆菌fua033，该菌种可以发酵生产尿石素a，同时也可生产发酵蛋白酶和脂肪酶。本发明提供的发酵粘液乳杆菌fua033安全性高，适用性好，耐受性强，益生性显著，菌株的高自凝聚作用不仅有利于提高其在肠道中的水平，还有利于菌体在小肠黏膜上定植，共同促使有益菌更好发挥益生功效，具有开发为下一代益生菌的潜力和显著的应用价值。