一种基于CRISPR/RfxCas13d系统的特异性敲低植物circRNA的方法

本发明涉及生物，特别涉及一种基于crispr/rfxcas13d系统的特异性敲低植物circrna的方法。

背景技术：

1、环状rna(circrna)是近年来加入非编码rna家族的新成员，具有共价闭合的环状结构，区别于大多数线性rna。研究表明，circrna结构稳定、种类丰富、序列保守、在细胞和组织中特异性表达，并具备很多潜在功能，在调控基因表达和各种生物学功能方面发挥着重要作用，可以作为生物传感器、调节剂和潜在治疗工具，为未来作物抗病育种提供新的策略和工具。

2、然而，由于circrna与其同源线性mrna除了反向剪接位点(bsj)外，共享重叠序列，这一特征使得很难区分circrna及其同源mrna的功能，因此，敲低circrna的水平而不影响其亲本基因的表达仍然是一个挑战。目前，通过rna干扰(sirna/shrna)敲低circrna，是人类和动物中常用的方法。但是，在植物circrna研究中，目前只能通过crispr-cas9系统直接敲除形成环状rna的外显子，或通过敲除侧翼序列中的反向互补序列来抑制circrna的生物发生，达到敲除circrna的目的，然而，由于circrna的序列与其亲本基因的序列几乎完全一致，因此，crispr-cas9系统对于只敲除circrna而不影响其亲本基因的表达通常达不到一个很好的结果。因此，目前植物circrna的特异性敲低还未有可行的办法。

3、rfxcas13d酶的平均长度为930个氨基酸，比其他cas13酶小20％，比cas9更是小33％。在向导rna的引导下，它能够敲低rna而不改变基因组。这些特性使rfxcas13d可以作为一种重要的mrna编辑工具，在不永久改变基因组序列的情况下影响基因表达，可开发为生物mrna编辑的实用工具。已有研究表明，动物细胞中rfxcas13d-bsj-grna介导的circrna的敲除效率平均为65％，而shrna的敲除效率为35％，表明crispr/rfxcas13d可广泛应用于circrna功能的研究。

4、因此，目前亟待克服现有技术中的困难，实现circrna编辑技术在植物体内的突破，构建能够适用于植物circrna敲低的crispr/rfxcas13d载体，靶向植物circrna bsj位点上的序列，有效且特异地区分环状rna和mrnas，对circrna进行特异性的敲低。这将极大的加快植物circrna的功能研究，进而实现植物育种中circrna功能增益突变体和新种质的开发。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于crispr/rfxcas13d系统的特异性敲低植物circrna的方法，用于解决现有技术中未能在植物体内实现对目的circrna特异性编辑的问题，极大的加快植物circrna的功能研究，进而实现植物育种中circrna功能增益突变体和新种质的开发。

2、本发明提供了一种基于crispr/rfxcas13d系统的特异性敲低植物circrna的方法，包括以下步骤：

3、s1、设计并合成植物密码子偏好性的编码rfxcas13d的目的基因序列，构建pcambia1300-rfxcas13d重组载体；

4、s2、合成atu6-crrna基因片段，所述atu6-crrna基因片段包含两个bsai酶切位点，构建pentr4:grna4-atu6-crrna重组载体；

5、s3、合成构建特异性靶向植物circrna bsj位点的pcambia1300-rfxcas13d-bsj-crrna载体；

6、s4、将构建好的pcambia1300-rfxcas13d-bsj-crrna表达载体介导转入植物愈伤组织，通过组织培养获得特异性敲低植物circrna的转基因植株。

7、优选的，步骤s1中，所述pcambia1300-rfxcas13d重组载体包括camv 35s启动子，潮霉素基因，camv poly(a)信号终止子，pvs1 repa，pvs1复制起点，水稻泛素化启动子，sv40 nls-rfxcas13d-sv40 nls和nos终止子。

8、优选的，步骤s1包括以下步骤：通过植物密码子偏好性优化编码rfxcas13d的目的基因序列并合成，直接克隆到线性化的puc57载体上，命名为puc57：rfxcas13d。以crispr/spcas9载体为基础，利用bamhi和ncoi对质粒puc57：rfxcas13d和crispr/spcas9载体进行双酶切，分别回收3003bp rfxcas13d基因片段和约12.6kb的crispr/spcas9载体骨架，利用t4 dna连接酶将3003bp rfxcas13d片段连接至crispr/spcas9载体骨架，质粒命名为pcambia1300-rfxcas13d，质粒测序后保存，验证成功后转化大肠杆菌保存。

9、优选的，sv40 nls-rfxcas13d-sv40 nls基因的碱基序列为seq idno.1。

10、seq id no.1(sv40 nls-rfxcas13d-sv40 nls)

11、atgtctccgaaaaaaaaaaggaaggtcgaggcgagcattgagaaaaagaagagctttgctaaaggtatgggggttaagagtacattggtgtccggttccaaagtgtatatgactacatttgcggaaggcagcgacgcaaggctggagaaaatagttgaaggcgattcaataagatcggtgaatgaaggagaagccttctccgctgaaatggccgacaaaaatgccggttataagattggtaacgctaagttctcgcacccaaagggttatgcagtcgtggcgaacaatccactgtacacaggtcctgtgcagcaggatatgcttggtttgaaggaaacgttggaaaagcggtacttcggtgagtccgctgacggcaatgataatatatgtattcaggtgatacacaacatcctcgatatagaaaaaatcctcgctgagtacattacaaatgccgcctacgcggtcaataacatatccggtttggacaaagacatcataggatttggaaaattctctacagtgtacacgtacgatgaatttaaagacccggagcatcacagagcagctttcaacaacaatgataagctcataaatgcaataaaagcgcaatatgatgaatttgacaactttcttgataacccgaggctgggctattttggtcaggctttcttcagcaaagaagggcgcaactatattataaattacggcaatgagtgctatgatattttggcattgttgtccggactgcggcattgggttgttcataataacgaggaagagagtaggatcagtcgcacatggctgtataaccttgataagaatctcgataatgagtatatttcgactttgaactacttgtatgatcgc

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38、aagaaagttagtgggaatagtggctcaggaccaaagaagaaaagaaaggttgcagcggcatatccgtacgatgtgc

39、cggattatgcgtga

40、优选的，rfxcas13d编码的氨基酸序列为seq id no.2。

41、seq id no.2

42、met ser pro lys lys lys arg lys val glu ala ser ile glu lys lys lysserphe ala lys gly met gly val lys ser thr leu val ser gly ser lys val tyrmetthr thr phe ala glu gly ser asp ala arg leu glu lys ile val glu gly aspserile arg ser val asn glu gly glu ala phe ser ala glu met ala asp lys asnalagly tyr lys ile gly asn ala lys phe ser his pro lys gly tyr ala val valalaasn asn pro leu tyr thr gly pro val gln gln asp met leu gly leu lys gluthrleu glu lys arg tyr phe gly glu ser ala asp gly asn asp asn ile cys ileglnval ile his asn ile leu asp ile glu lys ile leu ala glu tyr ile thr asnala alatyr ala val asn asn ile ser gly leu asp lys asp ile ile gly phe glylys pheser thr val tyr thr tyr asp glu phe lys asp pro glu his his arg alaala pheasn asn asn asp lys leu ile asn ala ile lys ala gln tyr asp glu pheasp asnphe leu asp asn pro arg leu gly tyr phe gly gln ala phe phe ser lysglu glyarg asn tyr ile ile asn tyr gly asn glu cys tyr asp ile leu ala leuleu sergly leu arg his trp val val his asn asn glu glu glu ser arg ile serarg thrtrp leu tyr asn leu asp lys asn leu asp asn glu tyr ile ser thr leuasn tyrleu tyr asp arg ile thr asn glu leu thr asn ser phe ser lys asn serala alaasn val asn tyr ile ala glu thr leu gly ile asn pro ala glu phe alaglu glntyr phe arg phe ser ile met lys glu gln lys asn leu gly phe asn ilethr lysleu arg glu val met leu asp arg lys asp met ser glu ile arg lys asnhis lysval phe asp ser ile arg thr lys val tyr thr met met asp phe val iletyr argtyr tyr ile glu glu asp ala lys val ala ala ala asn lys ser leu proasp asnglu lys ser leu ser glu lys asp ile phe val ile asn leu arg gly serphe asnasp asp gln lys asp ala leu tyr tyr asp glu ala asn arg ile trp arglys leuglu asn ile met his asn ile lys glu phe arg gly asn lys thr arg glutyr lyslys lys asp ala pro arg leu pro arg ile leu pro ala gly arg asp valser alaphe ser lys leu met tyr ala leu thr met phe leu asp gly lys glu ileasn aspleu leu thr thr leu ile asn lys phe asp asn ile gln ser phe leu lysval metpro leu ile gly val asn ala lys phe val glu glu tyr ala phe phe lysasp serala lys ile ala asp glu leu arg leu ile lys ser phe ala arg met glyglu proile ala asp ala arg arg ala met tyr ile asp ala ile arg ile leu glythr asnleu ser tyr asp glu leu lys ala leu ala asp thr phe ser leu asp gluasn glyasn lys leu lys lys gly lys his gly met arg asn phe ile ile asn asnval ileser asn lys arg phe his tyr leu ile arg tyr gly asp pro ala his leuhis gluile ala lys asn glu ala val val lys phe val leu gly arg ile ala aspile glnlys lys gln gly gln asn gly lys asn gln ile asp arg tyr tyr glu thrcys ilegly lys asp lys gly lys ser val ser glu lys val asp ala leu thr lysile ilethr gly met asn tyr asp gln phe asp lys lys arg ser val ile glu aspthr glyarg glu asn ala glu arg glu lys phe lys lys ile ile ser leu tyr leuthr valile tyr his ile leu lys asn ile val asn ile asn ala arg tyr val ilegly phe hiscys val glu arg asp ala gln leu tyr lys glu lys gly tyr asp ileasn leu lyslys leu glu glu lys gly phe ser ser val thr lys leu cys ala glyile asp gluthr ala pro asp lys arg lys asp val glu lys glu met ala glu argala lys gluser ile asp ser leu glu ser ala asn pro lys leu tyr ala asn tyrile lys tyrser asp glu lys lys ala glu glu phe thr arg gln ile asn arg glulys ala lysthr ala leu asn ala tyr leu arg asn thr lys trp asn val ile ilearg glu aspleu leu arg ile asp asn lys thr cys thr leu phe arg asn lys alaval his leuglu val ala arg tyr val his ala tyr ile asn asp ile ala glu valasn ser tyrphe gln leu tyr his tyr ile met gln arg ile ile met asn glu argtyr glu lysser ser gly lys val ser glu tyr phe asp ala val asn asp glu lyslys tyr asnasp arg leu leu lys leu leu cys val pro phe gly tyr cys ile proarg phe lysasn leu ser ile glu ala leu phe asp arg asn glu ala ala lys pheasp lys glulys lys lys val ser gly asn ser gly ser gly pro lys lys lys arglys val alaala ala tyr pro tyr asp val pro asp tyr ala*

43、优选的，步骤s2中，pentr4:grna4-atu6-crrna重组载体包括atu6启动子，crrna重复前导序列，含有两个bsai酶切位点的spacer核苷酸序列。

44、优选的，atu6-crrna基因片段的碱基序列为seq id no.3。

45、seq id no.3(atu6-crrna)

46、aagcttcattcggagtttttgtatcttgtttcatagtttgtcccaggattagaatgattaggcatcgaaccttcaagaatttgattgaataaaacatcttcattcttaagatatgaagataatcttcaaaaggcccctgggaatctgaaagaagagaagcaggcccatttatatgggaaagaacaatagtatttcttatataggcccatttaagttgaaaacaatcttcaaaagtcccacatcgcttagataagaaaacgaagctgagtttatatacagctagagtcgaagtagtgattgaacccctaccaactggtcggggtttgaaacagagaccagaattcggtctcatttttttttggatccactagtcctgcagg

47、优选的，步骤s2包括：利用hindiii线性化pentr4:grna4载体，回收线性化载体骨架，人工合成包含两个bsai酶切位点的atu6-crrna基因片段，通过hindiii酶切位点直接合成到pentr4:grna4载体上，得到pentr4:grna4-atu6-crrna载体，质粒测序后保存，验证成功后转化大肠杆菌保存。

48、优选的，步骤s3包括：针对circrna的bsj位点设计grnas靶向序列，合成rfxcas13d-bsj-grna靶点序列引物，通过引物退火的方式连接至bsai线性化的pentr4:grna4-atu6-crrna载体上；将上步构建好的pentr4:grna4-atu6-bsj-crrna载体为模板，设计带hindiii和sbfi酶切位点的引物，扩增出带hindiii和sbfi酶切位点的atu6-bsj-crrna片段，用hindiii和sbfi对pcambia1300-rfxcas13d重组载体进行双酶切，最后通过同源重组方式得到pcambia1300-rfxcas13d-bsj-crrna载体。进一步优选的，最后，通过pcr及酶切验证，质粒测序后保存，验证成功后转化大肠杆菌保存。得到特异性敲低circrna而不影响其亲本基因表达的crispr/rfxcas13d敲低载体。

49、优选的，所述植物包括水稻、番茄、拟南芥。

50、综上所述，本发明的方法，具有以下特征和优势：经过植物密码子优化的rfxcas13d不会影响植物正常生理活动；本发明提供了一种运用crispr/rfxcas13d敲低植物circrna的技术，通过运用crispr/rfxcas13d编辑系统，基于bsj位点，在植物体内通过crrna介导定向对靶circrna进行直接剪切敲低，实现精准打靶；本发明提供的技术摆脱了先前通过crispr-cas9技术敲除植物circrna的同时，其母本mrna也被敲除的局限性。本发明克服了现有技术的困难，实现了circrna编辑技术在植物体内的突破，将crispr/rfxcas13d体系转化为一种在植物体内发挥效用的实用性工具，利用本发明的技术可以用于植物circrna的功能研究，进而实现植物育种中circrna功能增益突变体和新种质的开发，将极大地加快生物编辑技术在生物工程、农艺种质创新的发展。

51、本发明与现有技术相比，其有益效果是：

52、1、本发明首次将crispr cas13d技术运用到敲低植物circrna的实验研究中；

53、2、本发明的方法整个操作实施过程简单有效；

54、3、本发明排除了对基因打靶位点的局限性，在针对植物circrna bsj位点的打靶过程中不会降低其母本mrna的表达，能够获得较高的植物circrna打靶效率；

55、4、利用本发明的技术可以用于植物circrna的功能研究，进而实现植物育种中circrna功能增益突变体和新种质的开发。