一种用于评估肿瘤转移性的肿瘤类器官芯片及方法

本发明属于医学及器官芯片领域，尤其涉及一种用于评估肿瘤转移性的肿瘤类器官芯片及方法。

背景技术：

1、肿瘤异质性一直被认为是阻碍个体化诊疗进步的一大障碍。其中，肿瘤转移性与肿瘤异质性密切相关，是恶性肿瘤的一种常见并严重的表现，对患者的生存率和生活质量有着极大的影响。肿瘤类器官是源自肿瘤组织中肿瘤特异性干细胞通过三维组织培养形成的细胞簇，它可模拟体内肿瘤特征及肿瘤细胞异质性，该技术的应用为肿瘤研究和治疗提供了可靠的模型，特别是为个性化肿瘤诊疗开辟了新的方案。目前，在体外利用肿瘤类器官技术评估肿瘤转移性的方法仍然十分缺乏。

2、传统的评估细胞迁移能力的方法包括transwell、细胞划痕等，这些方法无法模拟原发性肿瘤转移的过程，因此无法有效评估肿瘤的转移性。器官芯片技术能够模拟人体器官的功能，通过将微型芯片和生物材料组合，可以更加准确地研究和测试药物的效果、了解疾病的有关机制以及开发个性化诊疗方法等。但目前用于研究肿瘤转移的器官芯片大多仍采用传统的肿瘤细胞系构建模型，由于传统的肿瘤细胞系与患者来源的肿瘤细胞存在较大差异，因此难以重建真实的肿瘤转移过程，使得现有方法无法满足临床上的应用需求。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于评估肿瘤转移性的肿瘤类器官芯片。该芯片由患者来源的肿瘤类器官、transwell腔室、细胞培养芯片、基底组成，可以模拟人体内肿瘤生长和转移的生理过程。该芯片能够有效评估患者肿瘤细胞的侵袭能力和生长能力，为研究肿瘤的转移性以及相应的肿瘤治疗和药物研究提供了重要的工具。

2、为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

3、一种用于评估肿瘤转移性的肿瘤类器官芯片，所述用于评估肿瘤转移性的肿瘤类器官芯片包括患者来源肿瘤类器官、transwell腔室、细胞培养芯片、基底；所述患者来源肿瘤类器官是使用肿瘤患者的肿瘤组织或者患者血液中的循环肿瘤细胞，在体外进一步处理后，放入transwell腔室中进一步培养成肿瘤类器官；所述transwell腔室包括transwell腔室支架和transwell滤膜；所述细胞培养芯片包括孔位和腔室；所述细胞培养芯片的孔位用于放置transwell腔室，transwell腔室与细胞培养芯片中的腔室紧密配合；所述transwell腔室中的transwell滤膜将transwell腔室与细胞培养芯片中的腔室隔开；所述细胞培养芯片中的腔室用于收集和培养从transwell腔室中转移出的肿瘤细胞；所述基底为高生物兼容性的透明材质，在提供支撑的同时，用于实时观测肿瘤类器官芯片中的生长和转移情况。

4、进一步地，所述患者来源肿瘤类器官是通过使用肿瘤患者的肿瘤组织或者患者血液中的循环肿瘤细胞，在体外进一步处理后，得到的肿瘤类器官。

5、进一步地，所述transwell腔室支架的制作材料为高生物兼容性树脂或聚苯乙烯(ps)或聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)或聚二甲基硅氧烷(pdms)，所述transwell腔室支架的厚度范围为2-15mm。

6、进一步地，所述transwell滤膜的材质为聚碳酸酯(pc)或者聚四氟乙烯(ptfe)或者聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)，所述transwell滤膜上微孔的孔径范围为5-30μm。

7、进一步地，所述细胞培养芯片的制作材料为高生物兼容性树脂或ps或pmma或pdms，所述细胞培养芯片的厚度范围为2-15mm。

8、进一步地，所述基底为透明的聚合物薄膜或pdms薄膜或玻璃薄板或ps薄板或pmma薄板，所述基底的厚度范围为0.01-1mm。

9、本发明的另一方面，提供了一种采用上述装置评估患者肿瘤转移性的方法，该方法包括：对transwell腔室和细胞培养芯片进行消毒处理；对患者的肿瘤组织或者循环肿瘤细胞进行预处理；在transwell腔室中进行肿瘤类器官接种；在transwell腔室和细胞培养芯片的腔室中分别添加不同浓度的营养液，构建细胞营养浓度梯度；对转移后的肿瘤细胞进行观测；分析转移的肿瘤细胞簇与未转移的肿瘤类器官的区别并评估肿瘤的转移性。

10、进一步地，所述对transwell腔室和细胞培养芯片进行消毒处理包括紫外线消毒、高温灭菌或化学灭菌处理中的至少一个。

11、进一步地，所述对患者的肿瘤组织或循环肿瘤细胞进行预处理，包括：将手术切除的肿瘤组织收集到含有培养基的离心管中，培养基为dmem培养基混合10％的fbs胎牛血清；之后将样本取出置于无菌的细胞培养皿中，使用无菌手术刀清除周边坏死组织和脂肪组织，使用磷酸盐缓冲液(pbs)进行清洗；清洗后进行消化步骤得到酶解后的肿瘤细胞；再通过过滤、离心步骤得到备用肿瘤细胞悬液。

12、进一步地，所述在transwell腔室中进行肿瘤类器官接种，包括：

13、(1)对备用肿瘤细胞进行细胞计数，使用已预先添加大量生长因子的opti-mem与dmem/f12混合培养基进行重悬，肿瘤细胞的密度范围为1*105-1*108/ml；

14、(2)在4℃环境下，将肿瘤细胞悬液按1:1的体积比与基质胶(matrigel)进行混合，工作前将基质胶提前在冰上融化12小时，置入在transwell腔室中的体积范围为100-600μl，接种完成后，在37℃培养箱中倒置15-30分钟以达到凝固基质胶的目的；

15、(3)在transwell腔室中添加预先配好的含大量生长因子的opti-mem与dmem/f12混合培养基，培养基的体积范围为50-300μl，再将肿瘤类器官芯片放入培养箱中进行5天的类器官培养，每隔1天，更换培养基。

16、进一步地，所述在transwell腔室和细胞培养芯片的腔室中分别添加不同浓度的营养液，构建细胞营养浓度梯度，包括：在周边每个细胞培养芯片的腔室中添加含有三倍浓度细胞因子opti-mem与dmem/f12混合培养基，体积范围为10-100μl，在transwell腔室中添加含有正常浓度细胞因子的opti-mem与dmem/f12混合培养基，体积范围为50-500μl。

17、进一步地，所述对转移后的肿瘤细胞进行观测，包括光学显微镜观测、荧光染色观测、细胞活率观测中的一个或多个。

18、进一步地，所述分析转移的肿瘤细胞簇与未转移的肿瘤类器官的区别并评估肿瘤的转移性，包括蛋白表达分析，基因表达分析，基因测序分析中的一个或多个。

19、本发明提供的一种用于评估肿瘤转移性的肿瘤类器官芯片及方法的有益效果如下：

20、1、与其他用于评估细胞迁移能力的方法相比，本发明提供的用于评估肿瘤转移性的肿瘤类器官芯片，集成了仿生的transwell腔室，能够高效模拟肿瘤转移的过程。

21、2、本发明提供的用于评估肿瘤转移性的肿瘤类器官芯片，使用了患者来源的肿瘤类器官进行肿瘤转移性评估，能够真实地反映人体内肿瘤生长和转移的生理过程。

22、3、本发明提供的用于评估肿瘤转移性的肿瘤类器官芯片，结构简单、操作方便，能够实时观测肿瘤生长和转移的过程。

23、4、本发明提供的用于评估肿瘤转移性的肿瘤类器官芯片，能够有效推动个体化诊疗技术的发展，具有较好的临床应用价值。