一株防御假单胞菌QNF1及其微生物菌剂的应用

本发明涉及微生物，尤其涉及一种防御假单胞菌qnf1及其微生物菌剂的应用。

背景技术：

1、由子囊菌链核盘菌属真菌(monilinia spp.)引起的褐腐病是采后核果类果实重要的侵染性病害，在利于病害发生的条件下，导致高达80％的产量损失。在我国引起褐腐病的种主要果生链核盘菌(美澳型核果褐腐菌)(monilinia.fructicola)、梅生丛梗孢(monilinia.mumecola)、核果链核盘菌(monilinia.lara)以及云南丛梗孢(monilinia.vunnanen)，其中，美澳型核果褐腐病菌(monilinia.fructicola)是我国引起褐腐病的优势种，也被称为褐腐病菌(m.fructicola)。褐腐病菌(m.fructicola)是一个多寄主病原菌，不仅可以侵染桃、樱桃、李、杏、梅等核果类果树，而且还可侵染苹果、梨、沙果、山楂等仁果类果树，主要危害成熟期及储藏期的果实，容易引起再侵染，进而造成重大的经济损失。

2、生产应用中，主要通过各种杀菌剂对褐腐病菌(m.fructicola)进行防治。然而过多施用杀菌剂会产生如毒性残留、环境污染、病原菌抗性等诸多问题。因而，亟需探索新的绿色高效、环境友好的防控措施。利用拮抗微生物防控植物病害具有毒性低、污染少以及不易产生抗性等优点，是一种更安全、可持续的植物病害防控策略。近年来，已有较多针对褐腐病(m.fructicola)的拮抗菌研究，如公告号为cn 105820981 b的专利公布的高地芽孢杆菌14b和公告号为cn 105907669 b的专利公布的死谷芽孢杆菌12a均为从桃树根际土壤分离的拮抗菌，可有效防治桃褐腐病；但从植物中分离内生拮抗菌的报道相对较少。同时，目前兼具生态安全、食品安全要求的有商业化应用潜力拮抗菌资源较少，限制了拮抗菌生物防治技术在采后果实褐腐病控制中的生产应用。

3、因此，现有技术有待进一步改进。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的缺点与不足，本技术提供一株从韭菜根系中首次分离到的内生菌防御假单胞菌(pseudomonas protegens)qnf1，发酵液、无细胞上清液以及发酵液挥发物对褐腐病菌(m.fructicola)均有显著的拮抗作用，同时对褐腐病菌(m.fructicola)引起的桃果实褐腐病具有良好的抑制作用，而且能显著维持果实硬度和果实品质。

2、为解决上述技术问题，本技术提供以下的技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种防御假单胞菌(pseudomonas protegens)qnf1，该菌于2023年10月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmcc no.28587，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。生物学分类上，该菌属于假单胞菌属的防御假单胞菌种。

4、第二方面，本发明提供了上述防御假单胞菌(pseudomonas protegens)qnf1在拮抗褐腐病菌(m.fructicola)、苹果腐烂病菌(valsa mali)、梨腐烂病菌(valsa pyri)、苹果轮纹病菌(botryosphaeria dothidea)或苹果炭疽叶枯病菌(glomerella cingulata)中的应用。实验证明，本技术提供的防御假单胞菌qnf1对上述病原菌都具有优异的抑菌效果。

5、第三方面，本发明提供了防御假单胞菌(pseudomonas protegens)qnf1在防治褐腐病菌(m.fructicola)引起的果实褐腐病中的应用。

6、可选地，果树为桃、杏、樱桃、李等核果类果树或苹果、梨等仁果类果树。

7、第四方面，本发明提供了一种拮抗褐腐病菌(m.fructicola)的微生物菌剂，其活性成分包括如前所述的防御假单胞菌(pseudomonas protegens)qnf1。

8、可选地，所述微生物菌剂的活性成分为前述防御假单胞菌qnf1的发酵液、发酵液上清或挥发物。实验证明，防御假单胞菌qnf1的发酵液、发酵液上清或挥发物对褐腐病菌都具有显著的抑制作用。其中，发酵液对桃果实褐腐病的抑制率高达85.58％，发酵液挥发物对桃果实褐腐病的抑制率高达98.76％。

9、所述微生物菌剂可直接采用防御假单胞菌qnf1的发酵液、发酵液上清或挥发物进行应用，也可将其作为活性成分，再辅以载体以及其他助剂(如稳定剂、抗氧化剂等)等，制成更稳定或便于携带和运输的各种类型的制剂(如固体的颗粒制剂、液体的悬浮剂以及气体的喷雾剂等)，以便更好的实际生产中进行应用。

10、第五方面，本发明还提供前述的微生物菌剂活性成分的制备方法，该微生物菌剂活性成分为防御假单胞菌qnf1的发酵液，制备方法为：

11、将防御假单胞菌qnf1的菌落或菌液接种到液体培养基中，于26～29℃下在180～250r·min-1条件下振荡培养30～45h，得到防御假单胞菌qnf1的发酵液。

12、优选地，防御假单胞菌qnf1发酵液的制备方法为：将防御假单胞菌qnf1的菌落或菌液接种到200ml lb液体培养基中，于28℃下200r·min-1振荡培养36h，培养基初始ph值为7.0，得到镜检菌液浓度为1×1010cfu·ml-1的防御假单胞菌qnf1发酵液。

13、第六方面，本发明还提供所述微生物菌剂活性成分的制备方法，该微生物菌剂活性成分为防御假单胞菌qnf1的无细胞上清液，其制备方法为：

14、将防御假单胞菌qnf1的菌落或菌液接种到液体培养基中，于26～29℃下在180～250r·min-1条件下振荡培养10～15h，将菌液在5000～7000r·min-1的转速下离心8～15min，取上清液，再用无菌过滤器对上清液进行过滤，最后得到防御假单胞菌qnf1的无细胞上清液。

15、优选地，所述防御假单胞菌qnf1的无细胞上清液的制备方法为：将防御假单胞菌qnf1的菌落或菌液接种到200ml lb液体培养基中，置于28℃、200r·min-1条件下震荡培养12h。将菌液在6000r·min-1的转速下离心10min，取上清液，再用0.22μm无菌过滤器过滤三遍，得到防御假单胞菌qnf1无细胞上清液。

16、此外，该菌的发酵液挥发物的制备方法为：在直径为9cm的培养皿盖与培养皿中分别倒入10ml lb固体培养基、10ml pda固体培养基，待其凝固后，培养皿盖(lb培养基)上分别加入一定浓度的防御假单胞菌qnf1发酵液，并用涂布器涂抹均匀，晾干，将培养皿密封，培养皿内空间即为防御假单胞菌qnf1发酵液挥发物。

17、第七方面，本发明还提供前述防御假单胞菌qnf1或微生物菌剂在维持桃果实硬度中的应用。

18、优选的，所述应用方法为：将果实在防御假单胞菌qnf1的发酵液中进行浸泡，晾干后，再次浸泡在褐腐病菌(m.fructicola)菌液(1×104cfu·ml-1)中，可选地，浸泡时间为10～30min。

19、实验证明，在防御假单胞菌qnf1+mf处理组中，接种9天后，该处理组的果实的硬度为12.63，比对照(mf)果实高124.41％，差异极显著，这说明防御假单胞菌qnf1处理显著维持桃果实的硬度，具有一定的市场应用前景。

20、本发明具有以下有益效果：

21、(1)本发明首次从韭菜根系筛选分离出一株植物源内生菌-防御假单胞菌(pseudomonas protegens)qnf1菌株，实验表明，该菌发酵液、无细胞上清液以及发酵液挥发物对褐腐病菌(m.fructicola)均有显著的拮抗作用，对褐腐病菌(m.fructicola)引起的桃果实褐腐病具有良好的抑制作用；同时，该菌发酵液对苹果腐烂病菌(valsa mali)、梨腐烂病菌(valsa pyri)、苹果轮纹病菌(botryosphaeria dothidea)、苹果炭疽叶枯病菌(glomerella cingulata)的拮抗作用也十分显著；此外，其发酵液处理对果实品质无不良影响，属于兼具生态安全和食品安全、容易得到的褐腐病菌(m.fructicola)的微生物拮抗菌资源，且有助于维持果实硬度，延长货架期。

22、(2)防御假单胞菌qnf1菌株对褐腐病菌(m.fructicola)具有显著拮抗作用，实施例表明：其菌饼对褐腐病菌(m.fructicola)菌丝生长的抑制率可高达67.11％，其发酵液对褐腐病菌(m.fructicola)生物量的抑制率可高达95.93％，其无细胞上清液对褐腐病菌(m.fructicola)菌丝生长的抑制率可高达97.95％，其发酵液挥发物对褐腐病菌(m.fructicola)菌丝生长的抑制率可高达95.35％。

23、(3)防御假单胞菌qnf1菌株对褐腐病菌(m.fructicola)引起的桃果实褐腐病具有良好的抑制作用，实施例表明：其发酵液对桃果实褐腐病的抑制率高达85.58％，其发酵液挥发物对桃果实褐腐病的抑制率高达98.76％。

24、(4)防御假单胞菌qnf1菌株对其他果树病菌具有显著拮抗作用，实施例表明：其发酵液对苹果腐烂病菌(valsa mali)、梨腐烂病菌(valsa pyri)、苹果轮纹病菌(botryosphaeria dothidea)、苹果炭疽叶枯病菌(glomerella cingulata)生物量的抑制率分别为92.45％，88.69％，95.06％，89.72％。

25、(5)基于防御假单胞菌qnf1菌株的微生物菌剂发酵工艺简单、生产成本低廉，有利于其在采后果实褐腐病控制中的生产应用。