一种预测结直肠癌肝转移术后复发的NGSpanel及应用

本发明涉及结直肠癌肝转移术后复发预测，更具体地说是涉及一种预测结直肠癌肝转移术后复发的ngs panel及应用。

背景技术：

1、目前，结直肠癌是世界上第三常见的恶性肿瘤，肝脏是结直肠癌最常见的转移靶器官。手术切除是结直肠癌肝转移(colorectal livermetastases,crlm)患者获得长期生存的主要手段，患者的5年生存率可达到40-50％，10年生存率可达到20-30％，但是只有20％的患者有手术切除的机会。结直肠癌肝转移根据确诊时和根治术后两个时间点分为同时性肝转移和异时性肝转移。有15-25％的结直肠癌患者在确诊时即合并有肝转移，另有15-25％患者在结直肠癌原发灶根治术后可发生肝转移；大约50％-60％的crc患者在根治性切除后会发生异时性肝转移，大约15％-25％的crc患者在初次诊断肠癌时发现伴有肝转移。

2、传统的消化道肿瘤标志物如cea、ca199在结直肠癌的诊断中起着重要的作用，但是对肝转移没有明显预测作用。因此探究结直肠癌肝转移的发病机制，并寻找更特异的生物标志物是改善结直肠癌肝转移患者预后的关键。

3、循环肿瘤dna(circulatingtumordna,ctdna)是一个预测微小残留疾病的有效手段。对于复发风险高的患者，应该接受更为强效的术后辅助治疗以及密切监测，而复发风险低的患者，应该避免过度治疗。基于检测ctdna判断是否存在mrd的方法，已经在其他恶性肿瘤中所应用。目前，仅有限的临床研究探讨了ctdna在结直肠癌肝转移中的应用价值。但是，仍旧包括一些具体细节问题尚未确定。包括血液采集的最佳时间点、ctdna测序深度以及使用ctdna预测复发的敏感性和特异性。

4、二代测序技术(ngs)的出现为肿瘤的易感基因检测、伴随诊断、个性化用药等提供了更佳的技术支撑和选择，尤其是基于ngs的癌症panel检测使得该领域检测可以更加快速和低廉，达到了同时检测若干个基因和变位点的目的。

5、因此，如何提供一种预测结直肠癌肝转移术后复发的ngs panel并将其应用预测是否发生直肠癌肝转移术后的复发中是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的之一是提供一种预测结直肠癌肝转移术后复发的ngspanel，所述ngs panel包括tp53、apc、kras、pik3ca、fat4、fbxw7、smad4、amer1、tcf7l2、atm、arid1a、lrp1b、braf、ctnnb1、erbb2、erbb4、ptprs、axin2、pten、ptprt、smad3及sox9基因的转录区。

2、本发明的另一目的在于提供所述的预测结直肠癌肝转移术后复发的ngspanel在制备诊断结直肠癌肝转移术后是否复发的试剂盒中的应用。

3、本发明的另一目的还在于提供一种预测结直肠癌肝转移术后复发的试剂盒，包括所述的ngspanel。

4、在上述应用中，预测结直肠癌肝转移术后是否复发的方法为：

5、1)dna提取及核酸片段化。取患者术前全血，术前全血经离心获得血浆样本，提取血浆中cfdna并稀释至0.5ng/μl～1ng/μl，使用核酸打断仪处理肿瘤组织样本dna和血细胞样本dna获得片段化的肿瘤组织样本dna和片段化的血细胞样本dna。

6、2)dna文库构建。使用roche的kapa hyper prepkit(kk8504)试剂盒，对片段化的肿瘤组织样本dna、片段化的血细胞样本dna进行末端修复加a，使用roche的kapa hifihotstart readymix(kk2602)试剂盒进行预扩增反应，通过beckman的ampure xp beads将预扩增产物纯化至新的ep管，即为肿瘤样本dna文库。

7、3)利用探针捕获目标区域片段，构建捕获后dna文库。将不同样本dna文库按照等质量比混合，并置于真空离心浓缩仪中60℃蒸干约20min得到蒸干的文库；向蒸干后的dna文库加入dna杂交体系和杂交探针，震荡混匀离心后室温孵育，按照95℃-30s，70℃-hold的16个小时杂交反应条件进行杂交；杂交后的文库使用市售试剂盒xgen hybridization andwash kit(1080584)进行目标区域杂交捕获和杂交后洗脱，洗脱后的带目标区域片段的beads再使用kapa hifi hotstart readymix(kk2602)试剂盒进行杂交后扩增反应，最后用beckman的ampure xp beads将预扩增产物纯化至新的ep管，即为探针杂交捕获后dna文库。在实施例中，还可以对dna文库进行qubit浓度检测。在实施例中，也可以使用市售试剂盒twist standard hyb and wash kit(104447)行目标区域杂交捕获和杂交后洗脱，可以达到相同效果

8、4)文库测序，获得测序数据，具体为：用基因测序仪对文库用illumina的novaseq6000进行双端150测序，目标区域深度为6000-2000乘。

9、5)获取患者基因组突变信号，即：将获得的测序数据预处理后与hg19人类参考基因组比对，获得样本dna突变信号，保留只存在肿瘤样本的dna突变信号作为基因组突变信号，dna突变信号包括体细胞变异(snv)、插入缺失(indel)或其他类型突变中一种或多种。具体包括如下步骤：测序数据预处理及比对，包括去除接头和低质量碱基、比对至hg19人类参考基因组序列、去重、重比对和质量值矫正，获得校正后的bam文件。再将去接头后的fastq文件作为paired reads，分别使用bwa men模块比对到hg19人类参考基因组序列。再使用picard(2.8.1版)去除由于pcr原因导致的重复。再使用gatk(4.0版)的filtermutectcalls模块过滤掉某些指标不满足软件默认条件的突变，具体指标包括：map_qual，base_qual，germline，fragment，normal_artifact，position和haplotype。

10、6)确定突变个数，先确定单链一致性序列(sscs)，将具有相匹配fragment信息的fragment作为一组，其中相匹配fragment信息指在1bp的误差范围内的umi序列、起始位置或插入片段差异等，具有几乎完全相同的fragment信息，从最终追踪突变信号序列的基因组起始位置所对应的fragment上的碱基位置开始，到追踪突变序列的基因组终止位置所对应的fragment上的碱基位置截止，逐碱基的比较每个位置上每种碱基类型的个数，碱基类型包含a，t，c，g，；确定sscs，如果满足，则sscs在该位置上的碱基类型为个数最多的碱基类型，否定一致性序列在该位置上的碱基类型标记为n，其中表示个数最多的碱基类型的个数，表示个数第二多的碱基类型的个数。对每一个追踪突变，定义与追踪突变信号序列完全匹配的sscs为一个simplex，具有配对umi序列的两个simplex定义为1个duplex。如果满足simplex个数大于0，同时duplex个数大于1，则报告该突变为一个阳性突变。定义突变位点的umi比该位点的总umi为突变频率。

11、7)检测结果输出，结合所有追踪突变信号的检测结果得到待测患者的检测结果，即经过上述严格过滤后仍然有大于预先设置阈值个数的阳性突变和突变频率的，则定义该患者状态为阳性，否则为阴性。

12、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种用于结直肠癌肝转移的复发监测的基因panel及方法，该panel包括在癌症发生发展中起重要作用的基因：tp53、apc、kras、pik3ca、fat4、fbxw7、smad4、amer1、tcf7l2、atm、arid1a、lrp1b、braf、ctnnb1、erbb2、erbb4、ptprs、axin2、pten、ptprt、smad3、sox922个基因的转录区，在实际应用时，通过采集受检者的肿瘤组织样本及全血样本，进行肿瘤含量评估、dna提取、建库、捕获、测序、生物信息学分析、医学解读，从而对患者的预后进行预测，结合患者的临床、病理特征对患者的复发风险进行分层，从而指导辅助治疗。