一种CM4抗菌肽的基因工程制备方法及其应用与流程

本发明涉及一种基因制备方法及其应用，更具体一点说，涉及一种cm4抗菌肽的基因工程制备方法及其应用，属于生物基因工程领域。

背景技术：

1、近年来，由于抗生素的大量使用，某些病原体对药物产生了耐药性，抗生素难以有效地控制疾病的发生，而筛选新的抗生素需要比较长的周期，也极为困难。由于抗生素自身的作用机理，其对真菌感染没有明显作用。而抗菌肽具有不错的抗菌能力，并对真菌、病毒、寄生虫甚至癌细胞都有一定的杀伤作用，并且没有其他较大的副作用，在疾病治疗和药物研究上是不错的研究方向。因此，抗菌肽有广阔的应用前景，有望成为治疗癌症、抵抗病毒和菌类方面的潜在治疗药物。目前抗菌肽种类主要包括以下种类：

2、1.α-螺旋型抗菌肽：

3、α-螺旋型抗菌肽以cecropins和magainins家族为代表。cecropins又称为天蚕素，大概有30左右，含有31～39个氨基酸残基，分子量为4kd左右，不含半胱氨酸残基，不形成分子内二硫键；magainins是由非洲爪蟾皮肤中分离出的一组广谱阳离子型抗菌肽，含有21～27个氨基酸残基，不存在半胱氨酸残基，分子可以形成两亲α-螺旋结构，c端呈疏水性，n端呈亲水性。

4、2.β-折叠型抗菌肽：

5、此类抗菌肽种类很多，大多具有反平行的β-折叠结构，分子量为4～6kd，依靠2～3个二硫键维持其结构的稳定，主要包括哺乳动物α-防御素、β防御素、植物防御素和昆虫防御素等。α-防御素是由29～36个氨基酸残基组成的小分子多肽，其中6个高度保守的半胱氨酸形成3对二硫键；β-防御素由38～42个氨基酸组成，同样含有6个高度保守半胱氨酸残基组成的3对二硫键。

6、3.富含某类氨基酸的抗菌肽：

7、此类抗菌肽一般含有15～34个氨基酸残基，脯氨酸、精氨酸或甘氨酸的存在使肽链结构更加灵活，它们一般位于带正电的双亲螺旋n端与疏水c端的连接部位，对抗菌活性起重要作用。

8、4.具有环状结构的抗菌肽：

9、此类抗菌肽在c末端有一个分子内二硫键，从而在c末端形成一个环链结构，而n末端则为线状结构。如青蛙皮肤细胞产生的brevinins和牛中性粒细胞分泌的bactenecin均属于此类。这类抗菌肽通常有较强的抗菌活性。

10、抗菌肽的理化性质：抗菌肽通常是由13～52个左右的氨基酸残基构成，大多数都具有较好的水溶性。大部分抗菌肽等电点大于7，表现出较强的阳离子特征，且具有良好的热稳定性。同时，抗菌肽抗酸碱能力较强，对离子强度也有较强的抵抗作用。此外，部分抗菌肽还具备抵抗某些蛋白酶水解的能力。抗菌肽的抑菌效果与所带的正电荷有一定的关系。一般来说，肽链中含有大量带正电荷的氨基酸，在一定范围内抑菌强度随着所带净正电荷的增加而增强。大多数抗菌肽的疏水性在50％左右，对于有些抗菌肽来说，随着疏水性的增强其抑菌作用会得到加强但会牺牲其特异性。

11、抗菌肽结构简单，无高级结构，一般无翻译后修饰。纯化天然来源的抗菌肽难度较大，且其产量低，通过化学方法来合成则较为昂贵，经济费用高。采取大肠杆菌表达系统表达抗菌肽，既利用了该系统的优点，又避开了其缺点，一次大肠杆菌重组表达是一种很有应用潜力的获得抗菌肽的方法。但由于抗菌肽自身的抑制宿主菌的作用，导致原核表达产量低或不表达。而且抗菌肽在生物中含量少，提取步骤十分的复杂，难以从天然产物中进行直接提取，而化学合成法成本不低，且污染严重。因此，基因工程成为抗菌肽的主要生产方法，目前国内外许多实验室也进行了相关研究，但在真核表达系统如酵母菌中表达的抗菌肽n端修饰不完全，且产量较低，难以满足医药层面的需求。虽然大肠杆菌具有很多优良特性，比如它容易培养、生长的周期很短，而且培养的成本低，但表达的抗菌肽单体对宿主菌有毒害作用，对表达产量有一定影响。因此抗菌肽的应用受到了极大的制约。

12、因此，抗菌肽的深入研究与应用对我国的许多行业的发展具有重要意义，尤其是医药食品等行业。结合我国国情，加强对抗菌肽的摸索和研究是必然趋势，对促进抗菌肽的规模化制备和应用有不可忽视的作用。

技术实现思路

1、为了解决上述现有技术问题，本发明提供具有能够降低生产成本，解决原核表达载体系统表达抗菌肽产量低的难题等技术特点的一种cm4抗菌肽的基因工程制备方法及其应用。

2、为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种cm4抗菌肽的基因工程制备方法，该方法包括：抗菌肽cm4融合串联序列的设计与合成，首先，设计含导肽序列phoa的多倍体融合序列，其次，抗菌肽cm4单体之间引入甲酸切割位点，然后直接合成获得设计好的目的融合序列，最后，通过基因合成获得含目的融合基因的重组载体puc-19-8×cm4。

4、优选的，所述目的融合序列由限制性内切酶位、导肽、n×(甲酸位点+抗菌肽)、限制性内切酶位点组成。

5、优选的，所述限制性内切酶位为ecor i，导肽为phoa，n取值为1-10，优选5-8，n属于正整数。所述限制性内切酶位为hind iii位点。

6、优选的，所述目的融合序列为：

7、gaattcatgaaacaaagcactattgcactggcactcttatcgttactgtttacccctgtgacaaaagccgacccgcgttggaagatctttaagaaaatcgaaaaggttggtcagaacatccgtgacggtatcgttaaggctggtccggctgttgctgttgttggccaggctgccactatcgacccgcgttggaagatctttaagaaaatcgaaaaggttggtcagaacatccgtgacggtatcgttaaggctggtccggctgttgctgttgttggccaggctgccactatcgacccgcgttggaagatctttaagaaaatcgaaaaggttggtcagaacatccgtgacggtatcgttaaggctggtccggctgttgctgttgttggccaggctgccactatcgacccgcgttggaagatctttaagaaaatcgaaaaggttggtcagaacatccgtgacggtatcgttaaggctggtccggctgttgctgttgttggccaggctgccactatcgacccgcgttggaagatctttaagaaaatcgaaaaggttggtcagaacatccgtgacggtatcgttaaggctggtccggctgttgctgttgttggccaggctgccactatcgacccgcgttggaagatctttaagaaaatcgaaaaggttggtcagaacatccgtgacggtatcgttaaggctggtccggctgttgctgttgttggccaggctgccactatcgacccgcgttggaagatctttaagaaaatcgaaaaggttggtcagaacatccgtgacggtatcgttaaggctggtccggctgttgctgttgttggccaggctgccactatcgacccgcgttggaagatctttaagaaaatcgaaaaggttggtcagaacatccgtgacggtatcgttaaggctggtccggctgttgctgttgttggccaggctgccactatctaaaagctt。

8、优选的，所述目的融合序列的氨基酸序列为：

9、mkqstialallsllftpvtkadprwkifkkiekvgqnirdgivkagpavavvgqaatidprwkifkkiekvgqnirdgivkagpavavvgqaatidprwkifkkiekvgqnirdgivkagpavavvgqaatidprwkifkkiekvgqnirdgivkagpavavvgqaatidprwkifkkiekvgqnirdgivkagpavavvgqaatidprwkifkkiekvgqnirdgivkagpavavvgqaatidprwkifkkiekvgqnirdgivkagpavavvgqaatidprwkifkkiekvgqnirdgivkagpavavvgqaati。

10、优选的，还包括抗菌肽cm4融合串联重组表达载体的构建，具体为：

11、提取含有目的融合序列的puc-19-8×cm4重组质粒；通过ecor i和hind iii双酶切puc-19-8×cm4重组质粒，凝胶回收小片段；通过ecor i和hind iii双酶切pet-28a载体，凝胶回收大片段；将上述酶切获得的大、小片段连接；将连接好的表达载体转化入tg1感受态细胞，涂布抗性平板；提取重组质粒，通过pcr与双酶切鉴定，获得cm4串联重组表达载体pet-28a-phoa-8×cm4。

12、优选的，还包括抗菌肽cm4串联融合蛋白的表达和分离纯化，具体为：

13、将重组表达载体pet-28a-phoa-8×cm4转化bl21感受态细胞，培养获得重组工程菌；通过iptg诱导工程菌表达cm4串联目的产物，通过sds-page分析表达结果；通过融合蛋白镍柱亲和纯化。

14、优选的，还包括抗菌肽cm4串联产物的切割，具体为：

15、用甲酸切割纯化的cm4串联蛋白；分离纯化抗菌肽切割单体

16、优选的，通过管碟法测定cm4抗菌肽切割单体的抗菌活性。

17、本发明cm4抗菌肽在在食品、药物、饲料添加剂上的应用。

18、有益效果：本发明能够降低生产成本，解决原核表达载体系统表达抗菌肽产量低的难题，为抗菌肽的规模化生产奠定了基础；制备的抗菌肽可以用于替抗产品的开发，能够广泛用于食品、医药、饲料添加剂的制备；通过串联表达产物没有抗菌活性，不对宿主进行抑制，使得其表达量大大提高，能高效表达；对串联表达产物进行纯化，用甲酸切割串联产物，分离得到抗菌肽单体并进行抗菌活性检测可知，抗菌肽进行串联表达有助于提高抗菌肽在大肠杆菌中的表达量；phoa信号序列可将外源蛋白分泌表达至大肠杆菌细胞周至空间，有利于保持外源蛋白的天然构象和稳定性，使抗菌肽的规模化制备得以实现；