储库型水蛭素融合蛋白及其应用

本发明属于生物医药，具体涉及一类储库型水蛭素融合蛋白及其在制备血栓防治药物中的应用。

背景技术：

1、心脑血管疾病的发病率和死亡率在全球非传染性疾病中高居首位。血栓形成是此类疾病最常见的的致病因素。病理状态下，机体的凝血系统和抗凝系统发生异常，导致血栓的形成。体内血栓既可能在原位阻塞血管，也可能剥落并随血流转移至其他部位，阻塞其他血管，引发邻近的组织和器官缺血缺氧。根据堵塞部位不同，可诱发缺血性脑卒中、心肌梗塞、肺栓塞等疾病，严重时甚至导致死亡。

2、目前临床上已有多款抗血栓药物上市，通过作用于凝血过程的各个步骤，或是发挥溶栓作用，防止血栓的形成或是加速血栓的溶解，主要包括抗凝类药物、抗血小板类药物和溶栓类药物。水蛭素是一种从水蛭唾液腺中提取的多肽，能与凝血酶特异性结合以防止血栓形成，已被开发为一种有效的抗凝血剂。fda先后批准重组水蛭素及其衍生物，如来匹卢定(lepirudin)、地西卢定(desirudin)、比伐卢定(bivalirudin)，用于血栓栓塞性疾病预防并发症、外科手术后预防动脉血栓及预防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成。但是，作为多肽类生物药物，重组水蛭素及其衍生物体内半衰期短，临床使用患者必须频繁注射以实现长期抗凝效果，导致病人依从性低，且存在临床频繁注射造成的感染性风险。

3、围绕长效化蛋白/多肽类生物药物的开发一直是生物医药领域的研究热点。现有策略主要有制剂包载或衍生化修饰。常用的制剂有微球、植入剂等，已有多款产品上市。然而，蛋白/多肽药物长效制剂开发中普遍存在制备工艺复杂、载药量不高、载体和蛋白药物相容性不佳，以及聚合物载体的体内降解性、降解产物的蓄积毒性等诸多问题。蛋白/多肽药物衍生化修饰长效策略主要包括聚乙二醇(peg)修饰、融合长效化片段等。peg等化学修饰存在产物杂泛、随机修饰影响蛋白药物活性等局限。并且已上市的多数peg修饰和融合蛋白衍生化长效蛋白的长效性能有待进一步提高。

4、此外，抗凝药物的临床应用普遍存在出血副作用，长效制剂的开发会增加出血风险。安全、高效、可精准调控的水蛭素长效制剂亟待开发。

技术实现思路

1、本发明的目的之一是提供一类储库型水蛭素融合蛋白，具有原位聚集/自组装和生物活性“关-开”可控的特性。

2、所述融合蛋白包括三部分：a部分为水蛭素或水蛭素衍生物，b部分为多肽聚合物，c部分为血栓靶向肽，其中a部分和b部分之间通过血栓形成相关酶的识别序列连接。

3、在本发明中，所述水蛭素为重组水蛭素，包括水蛭素变异体1、水蛭素变异体2和水蛭素变异体3；所述水蛭素衍生物可以是现有报道的水蛭素衍生物，如来匹卢定、地西卢定、比伐卢定等。

4、进一步地，所述多肽聚合物为类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptide，elp)、类丝弹性蛋白聚合物(silk-elastinlike protein-based polymers，selps)或包含类弹性蛋白多肽elp的嵌段聚合物。

5、所述包含类弹性蛋白多肽的嵌段聚合物由类弹性蛋白多肽和另一种多肽形成，另一种多肽可以为类丝素蛋白多肽(silk-like polypeptides，slp)、类蛛丝蛋白多肽(spider silk-like polypeptides，sslps)、类胶原蛋白多肽(collagen-likepolypeptides，clps)或自组装多肽(self-assembling peptides，saps)。包含类弹性蛋白多肽的嵌段聚合物的结构可以为类丝素-弹性蛋白多肽、类蛛丝-弹性蛋白多肽、类胶原-弹性蛋白多肽、自组装多肽-类弹性蛋白多肽。

6、类弹性蛋白多肽(elp)是基于天然弹性蛋白氨基酸序列设计合成的重复单元组成的温度响应性多肽聚合物。elp具有良好的生物相容性、生物可降解性和非免疫原性。elp具有临界相转变温度tt，当温度低于tt时，elp高度可溶；当温度高于tt时，elp聚集成不溶性微团聚体；利用该性质选择合适的elp，使其在室温可溶而在人体内聚集成微团聚体，延缓药物释放。

7、嵌段聚合物是一类由温度敏感性模块和可组装模块串联重复组成的嵌段共聚物型生物材料。温度敏感性模块来源于类弹性蛋白，可组装模块来源于类丝素蛋白、类蛛丝蛋白多肽、类胶原蛋白多肽或自组装多肽，通过形成β-折叠，β-转角，α-螺旋或三螺旋结构促进融合蛋白自组装成胶。通过调节不同模块的氨基酸序列、重复数目和排列顺序，可以调节多肽聚合物的相变温度与组装行为，获得一类低温溶解状态，在20-37℃温度可发生聚集沉淀或组装形成水凝胶的多肽聚合物。

8、具体地，所述类弹性蛋白多肽elp，为重复氨基酸序列①(vpgxg)n，其中x是除脯氨酸以外的任何一种氨基酸；②(vpxzg)n，其中x，z分别为带正电和负电的氨基酸；③(ggvp)n或④(gvgvap)n。

9、具体地，所述类丝素蛋白多肽，为重复氨基酸序列①(gagags)n；②[(gaga)ng(y/s)]m或③(gagagagx)n，其中x＝e,n,f,s,v,y,h,k或q。

10、具体地，所述类蛛丝蛋白多肽，为重复氨基酸序列①(poly a)n，②(gpgqq)n，③(gpgxx)n，④(ggx)n或⑤(gx)n，x＝a,s,t or v。

11、具体地，所述类胶原蛋白多肽，为重复氨基酸序列①(gpp)n；②(gpx)n，x＝hydroxyproline or hydroxylysine；③(gpp)n(gxp)m，x＝l or e；或④(gpp)n(gpx)m，x＝d or r。

12、具体地，所述自组装多肽，其为重复氨基酸序列(rada)n。

13、进一步地，所述血栓靶向肽为creka、gprp、rgd、kygcrgdwpc、gnqeqvspltllkc、leknsty、cqqhhlggakqagdv、gprpvtseihlk、nsdsecplshdgyclhdgvcmyiealdkyacncvvgyigercqyrdlkwwelr肽。

14、进一步地，所述血栓形成相关酶为激活的凝血因子vii(fviia)、凝血因子ix(fixa)、凝血因子xa(fxa)、凝血因子xi(fxia)、凝血因子xii(fxiia)、凝血因子xiii(fxiiia)或凝血酶(thrombin)。

15、在本发明中，所述融合蛋白的n端还连接有增溶标签ffu312。

16、在本发明中，所述融合蛋白的选自以下结构：

17、(1)从n端到c端依次连接的增溶标签ffu312、多肽聚合物、血栓形成相关酶的识别序列、水蛭素或水蛭素衍生物、血栓靶向肽；

18、或(2)从n端到c端依次连接的增溶标签ffu312、血栓靶向肽、多肽聚合物、血栓形成相关酶的识别序列、水蛭素或水蛭素衍生物。

19、或(3)从n端到c端依次连接的增溶标签ffu312、水蛭素或水蛭素衍生物、血栓形成相关酶的识别序列、多肽聚合物、血栓靶向肽。

20、如图1所示，本发明的水蛭素融合蛋白经皮下注射，在体内温度作用下，形成原位储库缓慢释放。进入血液循环的融合蛋白由于水蛭素氮端修饰，其抗凝活性被抑制，而在病灶部位相关酶特异性作用下，响应性肽链被降解，释放出水蛭素或其衍生物，与凝血酶结合，发挥抗凝作用抑制血栓形成。该融合蛋白在发挥长效抗凝的同时，实现根据内环境血栓水平精确释药，显著降低水蛭素的出血副作用，大幅提高用药安全性，为治疗血栓栓塞类疾病提供了一种有效的新途径。

21、本发明的目的之二是提供上述融合蛋白在制备血栓防治药物中的应用。

22、本发明将多肽聚合物与水蛭素或其衍生物通过血栓形成相关酶的识别序列作为连接臂进行融合连接，并引入血栓靶向肽；借助ffu312增溶标签表达元件(cn105838694a)，实现融合蛋白在宿主菌株中的高效可溶性表达，表达所得的融合蛋白具有多肽聚合物的温度敏感特性，在皮下注射后原位聚集/组装形成储库缓慢释放。进入血液循环的融合蛋白由于水蛭素氮端封端，其抗凝活性被屏蔽，而达到病灶部位在激活的凝血因子特异性作用下，响应性连接臂被降解，释放出水蛭素及其衍生物，抑制凝血酶活性，发挥抗凝作用抑制血栓形成。

23、本发明不同于肝素、华法林、水蛭素等抗凝剂，是一类安全、有效的抗凝剂，对于防治血栓具有重要的意义。