一种人源化抗CD70纳米抗体、制备方法及其应用与流程

本发明涉及蛋白抗体，具体涉及一种人源化抗cd70纳米抗体、制备方法及其应用。

背景技术：

1、纳米抗体是一种源自骆驼科动物重链抗体可变区(vhh)的小分子单域抗体。骆驼体重链抗体仅由两条重链组成，天然缺失轻链。而传统抗体由包含轻链和重链的四条肽链组成。纳米抗体是最小的功能性抗原结合片段，其相对分子量仅为传统抗体的十分之一，兼具传统抗体与小分子药物的优势，可溶性高，不易聚集，耐高温、强酸、强碱等致变性条件，适合于原核及各种真核表达系统，完美克服了传统抗体的开发周期长，稳定性低，保存条件苛刻等缺陷。纳米抗体应用广泛，在治疗性药物、诊断试剂、科研领域等方面均有前景，正逐渐成为可代替传统抗体的新兴力量。

2、对纳米抗体的氨基酸序列和胚系基因分析表明，绝大部分纳米抗体属于vh iii家族，与人vh3家族高度同源，因此具有较低的免疫性原性。但在纳米抗体结构中，存在一些与人vh序列显著不同的氨基酸，主要集中在fr2和fr3区域，因此，纳米抗体还是存在一定的免疫原性。免疫原性产生的免疫反应可以激发机体产生抗药物抗体(ada)，从而降低药物的治疗效果，增加副作用和不良反应。因此，发展基于纳米抗体的治疗药物，必须对其人源化改造以降低它的免疫原性。从而适应于临床治疗。

3、进行抗体人源化时应遵循几个基本原则：保持或提高抗体分子的稳定性、溶解性以及生物活性；大大降低或者基本消除其免疫原性。

4、传统方法中，主要有两种人源化抗体的方法：cdr移植和表面重塑(resurfacing)。cdr移植，是将cdr区域从异种抗体直接移植到人类frs的过程。表面重塑是将非人抗体表面暴露的fr残基替换为人类抗体frs的相应残基，对亲本抗体在人体中的免疫源性降低到尽可能小的程度。

5、除此以外，当前生物信息学的发展和高通量测序技术产生的大容量抗体库数据的应用，通过计算机预测和评估免疫原性也成为对抗体人源化的一种趋势。

6、驼类的重链抗体和人体vh基因同源性高达80-90％，结构十分相似，都包含了3个高变区(hvr区)和4个骨架区(fr区)。人体内来源的vh与骆驼来源的vhh骨架区比较有十几个氨基酸不同，纳米抗体fr2骨架区有4个特征氨基酸残基。通常情况下，人源化纳米抗体与人类ighv基因产物的序列一致性，高于人源化小鼠vh结构域。纳米抗体和人源化纳米抗体常用的表达系统有大肠杆菌、酵母以及哺乳动物细胞等。

7、cd70是肿瘤坏死因子之一，属于一种ⅱ型跨膜蛋白，由胞外结合区、胞浆区、跨膜区三个区域组成。它与其受体相结合才能发挥作用。研究发现许多cd70在恶性的肿瘤中表达。特别是鼻咽癌，淋巴瘤，肾细胞癌及感染诱导的肿瘤中。因此，靶向cd70所开发的药物对于肿瘤治疗来说是一种很有潜力的策略，为肿瘤的治疗提供了新的研究方向。目前已经存在以cd70为靶点开发并应用到临床的抗肿瘤药物单克隆抗体、抗体药物偶联物等。总的来说纳米抗体人源化在疾病治疗方面尤其是肿瘤治疗中提供了新的思路，为纳米抗体今后在体内应用提供实验基础。

8、其中抗人cd70纳米抗体nb2b3和nb3b6分子量小(约18kda)，亲和力高，特异性较好，可以用于治疗和/或预防、或诊断cd70相关疾病例如肿瘤中的用途。但该纳米抗体来源于骆驼体内，对人体而言具有免疫原性，需要对其人源化改造。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是：本发明提供了一种人源化抗cd70纳米抗体、制备方法及其应用，解决了目前抗人cd70纳米抗体nb2b3和nb3b6对人体而言具有免疫原性的技术问题。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种人源化抗cd70纳米抗体，包括hunb2b3-1、hunb3b6-1、hunb2b3-2或hunb3b6-2，所述hunb2b3-1的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述hunb3b6-1的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述hunb2b3-2的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述hunb3b6-2的氨基酸序列如seq id no.4所示。

4、本发明的有益效果是：采用上述人源化后的hunb2b3-1抗体、hunb3b6-1抗体、hunb2b3-2抗体或hunb3b6-2抗体能够减轻人体对原本nb2b3抗体和nb3b6抗体的免疫原性，从而使上述两种抗体更好在人体内发挥功效，进而更好的起到对人cd70肿瘤疾病的诊断、预防和治疗效果。

5、第二方面，本发明提供了一种人源化抗cd70纳米抗体在用于诊断、预防或治疗表达cd70的肿瘤疾病中的应用。

6、第三方面，本发明提供了一种表达载体，包括上述的人源化抗cd70纳米抗体，所述表达载体包括pet22b载体。

7、第四方面，本发明提供了一种宿主细菌，包括上述的表达载体，所述宿主细菌包括bl21大肠杆菌、tg1大肠杆菌或wk6大肠杆菌。

8、本发明的有益效果是：通过使用宿主细菌，如bl21大肠杆菌以便于进行后续转染，便于操作。

9、第五方面，本发明提供了一种药物组合物，包括上述的人源化抗cd70纳米抗体、上述的表达载体或上述的宿主细菌，以及至少一种药学上可接受的载体。

10、本发明的有益效果是：通过药物组合物以起到对人体的表达cd70肿瘤疾病的直接抑制作用，从而减轻病症。

11、第六方面，本发明提供了一种试剂盒，包括上述的药物组合物。

12、本发明的有益效果是：通过试剂盒能够对人体内表达表达cd70肿瘤疾病进行检测和预防。

13、第七方面，本发明提供了一种人源化抗cd70纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：s1、对nb2b3和nb3b6进行人源化设计，得到hunb2b3和hunb3b6的氨基酸序列；s2、根据所述hunb2b3和hunb3b6的氨基酸序列分别选取模板dna链再pcr，得到hunb3b6和hunb2b3的基因片段；s3、根据所述hunb3b6和hunb2b3的基因片段分别构建pet22b-hunb3b6质粒和pet22b-hunb2b3质粒；s4、将所述pet22b-hunb2b3质粒和pet22b-hunb3b6质粒分别转染到宿主菌株内诱导得到分别表达hunb3b6和hunb3b6的菌株；s5、对分别表达hunb2b3和hunb3b6的菌株均进行亲和层析，即得到纯化的所述hunb3b6蛋白和hunb2b3蛋白。

14、本发明的有益效果为：通过该方法能准确诱导出可表达hunb3b6蛋白和hunb2b3蛋白的菌株，从而以方便纯化出上述两种蛋白，该方法操作简便，且具有较高的成功率。

15、进一步，上述s1中，所述hunb2b3包括hunb2b3-1和hunb2b3-2，所述hunb3b6包括hunb3b6-1和hunb3b6-2；所述hunb2b3-1和所述hunb3b6-1的人源化设计模板为人源化纳米抗体框架h-nbbcii10fgla，所述人源化纳米抗体框架h-nbbcii10fgla的氨基酸序列如seqid no.5所示。

16、其中当以人源化纳米抗体框架h-nbbcii10fgla作为模板时，采用vhh通用框架移植法进行人源化，抗体vh结构域由框架区(fr)和高变区(cdr)组成，采用imgt编码规则分别对nb2b3和nb3b6抗体的vh序列的编码进行划分，分别得到nb2b3的cdr序列和nb3b6的cdr序列，将这两段cdr序列分别移植到h-nbbcii10fgla上后即得到hunb2b3-1和hunb3b6-1的抗体序列。

17、进一步，上述hunb2b3-2和所述hunb3b6-2的人源化设计模板为igvh胚系基因ighv3-53*04，所述igvh胚系基因ighv3-53*04的氨基酸序列如seq id no.6所示。

18、其中当模板为igvh胚系基因ighv3-53*04时，采用表面重塑结合计算机预测和生物信息学分析的方法进行人源化，通过iggblast检索，发现人胚系基因ighv3-53*04与nb2b3和nb3b6均相匹配，根据该模板对nb2b3和nb3b6进行第9个aas突变后，即得到hunb2b3-2和hunb3b6-2的抗体序列。

19、进一步，上述pcr所用的上游引物的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.8所示。

20、本发明上述进一步的有益效果为：通过pcr得到实际的nb2b3和nb3b6基因序列，以便于后续转染。