一种多囊卵巢综合征的标志物及其应用

本发明属于生物医药领域，尤其涉及多囊卵巢综合征的精准医疗领域，更尤其涉及一种多囊卵巢综合征的标志物及其应用。

背景技术：

1、本部分的陈述仅仅是提供了与本发明相关的背景技术信息，不必然构成在先技术。

2、多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,pcos)是育龄妇女最常见的生殖内分泌疾病，影响10-12％的育龄妇女，是导致无排卵性不孕症的主要原因。它的典型特点是无排卵性不孕、高雄激素血症和卵巢多囊样改变，卵巢反应性异常等。临床上多囊卵巢综合征的表现多种多样、并不完全相同，区分其具体分型并进行个体化治疗十分必要。

3、关于多囊卵巢综合征的诊断标准，目前广泛应用的是2003年鹿特丹会议提出的诊断标准：1)临床或生化诊断为高雄激素血症：临床上患者有痤疮或多毛的临床表现；或在实验室检查中患者血清中雄激素水平升高或相关产物增加；2)稀发排卵或无排卵：pcos患者常伴月经周期不规律，稀发排卵指每年少于8次排卵，无排卵指超过6个月无月经；3)卵巢多囊样改变：在月经周期的第3-5天进行超声检查，显示双侧卵巢均有≥12个且直径2-9mm的小卵泡，和(或)卵巢体积增大；以上3个指标符合2个及2个以上即可诊断为多囊卵巢综合征。基于此可有多种经验分型如高雄型pcos和非高雄型pcos等，另外上述诊断条目都是基于传统的患者自述、激素检测或者超声检查，目前尚无有效的基因检测方法用于诊断及分子分型。

4、根据临床数据筛选具有适应证的标志物，并建立完善的pcos基因型-表型关联模型，根据基因型对pcos进行分类以实现早预防、早干预，有效避免远期并发症，提高pcos患者生活质量至关重要。

5、pcos是一种复杂的综合征，为了深入认识pcos，构建一个实用有效的动物模型十分必要。由于大鼠和小鼠体型小，繁殖周期短，具有较稳定的动情周期，对于实验研究既经济又方便,是最常用的实验动物之一。目前较常用的pcos动物模型是药物诱导模型，即雄激素注射包括孕期16.5天、17.5天、18.5天连续注射dht，所生子代可以模拟pcos部分生殖异常表型，青春期小鼠持续注射dhea21天，可以模拟pcos代谢异常表型。

6、另外，现有资料公开了dennd1a单碱基变异与pcos发生发展显著相关，以往的研究都是在基因组dna层面的研究，而基因发挥作用是在蛋白质层面。dennd1a具有两个转录本，美国弗吉尼亚州里士满弗吉尼亚联邦大学妇产科，构建了3个dennd1a转录本v2的过表达载体，并在卵巢组织中稳定表达，但同时发现转基因小鼠中，虽然dennd1a的mrna水平升高，但是其蛋白质表达水平较低，对研究及应用带来阻碍(doi:10.3390/ijms21072545)。所以，至今有关pcos的动物模型均无法有效模拟pcos所有表型。

7、从治疗层面而言，探寻并推广更加有效的精准的pcos诊疗方案是生殖医师的重任。目前针对pcos患者缺乏分型治疗方案，所有患者的治疗策略大同小异，并普遍存在着以治疗结局为导向的“头疼医头，脚疼医脚”的相关治疗方式。但在实际临床治疗中，病人对药物治疗反应不同、结局各异。而造成上述情况的主要原因，是对分型治疗方案研究的缺失。因此，目前急需根据pcos亚型靶点，进一步制定临床精准化、个体化治疗方案。

技术实现思路

1、为克服上述现有技术的不足，本发明的目的之一是提供一种可高效检测多囊卵巢综合征pcos的标志物，建立pcos基因型-表型因果关系模型；本发明的目的之二是提供一种能表征多数pcos表型的小鼠模型；本发明的目的之三，是根据所提出的pcos基因型-表型关系模型提供一种高精准预防、治疗pcos的sirna。

2、本发明中通过基因差异表达及特异性分析确定dennd1a转录本v1可以有效表征多囊卵巢综合征pcos，尤其是pcos的高雄分型，建立一个新的pcos基因型-表型关联模型。并通过基因沉默dennd1a转录本v1有效抑制pcos的各种表型。

3、另外本发明中利用crispr-cas9系统，在c57bl/6小鼠的6号染色体的rosa26基因定点敲入带标签的dennd1av1，有效过表达dennd1av1的mrna和蛋白质，获得了高雄激素血症、卵巢对fsh药物反应不良等遗传性动物模型。

4、为实现上述目的，本发明的一个或多个实施例提供了如下技术方案：

5、本发明的第一方面，提供一种用于多囊卵巢综合征诊断的标志物，所述标志物为dennd1a转录本v1；

6、具体的，dennd1a转录本v1的多核苷酸序列如seq id no.1所示。

7、在本发明的具体实施方式中，所述多囊卵巢综合征为高雄分型。

8、在本发明的具体实施方式中，所述标志物取自卵巢；进一步为卵泡；更进一步为颗粒细胞。

9、本发明的第二方面，提供一种用于检测第一方面所述的标志物的试剂，所述试剂包括引物和/或探针，

10、其中,检测dennd1a转录本v1的引物或探针分别为dennd1av1-f、dennd1av1-r；所述引物序列分别如seq id no.2、seq id no.3所示。

11、本发明的第三方面，提供一种检测产品，包括第二方面所述的引物、探针其组合及可接受的助剂；

12、优选的，所述产品包括芯片、试剂盒中的一种或多种。

13、本发明的第四方面，提供抑制dennd1a表达的物质在制备治疗多囊卵巢综合征药物中的应用；

14、所述应用具体表现为：

15、1)逆转转基因小鼠中fshr的分布紊乱；

16、2)恢复fsh信号通路的异常传导；

17、3)提高颗粒细胞对fsh的敏感性；

18、优选的，所述抑制dennd1a表达的物质包括靶向dennd1a的sirna；优选的，所述sirna的正义链序列为：gccagaacuucacauuugutt，反义链序列为：acaaaugugaaguucuggctt。

19、本发明的第五方面，提供一种多囊卵巢综合征的小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

20、将rosa26 grna、含有小鼠dennd1a的载体与cas9 mrna等摩尔比混匀为溶液，使用显微注射仪将所得溶液注射到已受精小鼠的受精卵胞浆中，将成活的受精卵移植到代孕母鼠体内，产生后代筛选获得。

21、在本发明的具体实施方式中，所述rosa26 grna的序列如seq id no.4所示；

22、所述小鼠dennd1a的载体含有cag启动子-小鼠dennd1a cdna-3xflag-polya的基因表达框；

23、所述小鼠dennd1a的序列如seq id no.5所示；

24、优选地，所述小鼠为与c57雄鼠合笼交配后的c57bl/6雌鼠；

25、优选地，所述筛选具体为：提取后代dna，鉴定有dennd1a基因的即为构建成功的模型。

26、通过以上方法构建了dennd1a的全身转基因小鼠(dennd1a tg c57bl/6小鼠)，同时该小鼠带有flag标签，有效解决了dennd1a有效抗体缺乏导致的生化分析难题。

27、本发明的第六方面，提供一种由第五方面所述的方法获得的多囊卵巢综合征模型小鼠，所述模型小鼠表现为：

28、1)生育率下降，具体为：动情周期不规则、促性腺激素刺激下获得卵母细胞数量显著减少；

29、2)卵泡发育受损；

30、3)高雄激素血症；

31、4)糖代谢异常；

32、5)促卵泡激素fsh靶基因表达异常；

33、6)卵泡刺激素受体fshr内吞异常。

34、本发明的第七方面，提供第七方面所述多囊卵巢综合征小鼠在耐药性研究、代谢通路研究及个性化治疗中的应用。

35、以上一个或多个技术方案存在以下有益效果：

36、本发明对采集临床患者109例pcos组患者和68名对照组卵巢颗粒细胞进行数据验证，发现pcos组卵巢颗粒细胞中dennd1av1 mrna水平较对照组显著升高，高雄型pcos组表达升高更明显，且dennd1av1的表达量与雄激素水平成正相关，与卵泡刺激素(fsh)的水平成负相关关系。且灵敏度、特异性高。表明dennd1a尤其是dennd1av1 mrna可作为诊断pcos的一种标志物。

37、本发明借助crispr-cas9技术构建了一种充分模拟pcos生殖与代谢表型的小鼠模型。通过分析发现小鼠模型中，dennd1a主要定位于卵巢颗粒细胞，dennd1a的mrna和蛋白质表达均升高。转基因小鼠表现出动情周期不规律、卵巢质量下降、高雄激素血症、卵泡发育异常、卵巢对促性腺激素不敏感、葡萄糖代谢异常等。

38、本发明中充分结合动物模型，针对dennd1av1设计了系列sirna，利用过表达dennd1av1的卵巢颗粒细胞进行挽救实验研究，发现其中1条sirna可以有效抑制dennd1a基因表达、改善卵巢颗粒细胞对fsh药物的敏感性，初步实现了以dennd1a为靶点的精准干预，为后续临床研究提供精细化治疗方案。

39、本发明还发现，dennd1a通过增强颗粒细胞中fshr内转运、在溶酶体中裂解fshr，阻碍了fshr的细胞内循环过程，导致颗粒细胞对卵泡刺激素(fsh)反应不敏感。dennd1a的敲降逆转颗粒细胞对fsh敏感性的降低。这些发现有助于了解多囊卵巢综合征的病理生理学，并可能有助于发现新的治疗靶点，改善患者临床表型及生育。

40、本发明附加方面的优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。