基于飞行时间核酸质谱技术检测阿尔兹海默病基因的核酸组合及应用的制作方法

本发明涉及基因检测，具体涉及一种基于飞行时间核酸质谱技术检测阿尔兹海默病基因的核酸组合及应用。

背景技术：

1、阿尔茨海默病(alzheimer’s disease ,ad)是一种中枢神经系统退行性变性疾病，主要的神经病理学改变包括β淀粉样蛋白aβ沉积形成的细胞外老年斑，微管相关蛋白tau过度磷酸化导致的神经细胞内神经纤维缠结、神经元丢失、淀粉样血管改变等。遗传因素、环境因素、吸烟饮酒等生活方式、心脑血管等基础疾病及年龄增长均为ad发生进展的危险因素，其中60-80%的风险由遗传因素解释。ad在临床前期难以发现和识别，确诊后主要为对症治疗，暂无特效药，因此ad的早期评估、诊断及预防至关重要。

2、根据发病年龄，ad可分为早发型ad(eoad，发病年龄＜65岁)和晚发型ad(load，发病年龄≥65岁)，eoad呈现家族聚集性，load则以散发性为主。截止目前，多个研究报道了单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)与ad易感的相关性，已经确定了40多个与ad相关的基因位点。

3、目前市场上存在多种针对基因多态性检测的技术平台，如taqman 探针法、snapshot法、飞行时间质谱分型、hrm(高分辨率熔解曲线)分型等技术平台。其中，基于时间飞行质谱完成的snp检测准确率可达99.9%，除了准确性高、灵活性强、通量大、检测周期短等优势外，还具有较高的性价比，飞行时间质谱平台是国际通用的基因单核苷酸多态性(snp)的研究平台，该方法凭借其科学性和准确性已经成为该领域的新标准。

4、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供检测阿尔兹海默病基因的核酸组合。

2、本发明的再一目的在于提供检测阿尔兹海默病基因的试剂盒。

3、本发明选取与阿尔兹海默病早发型家族性遗传致病相关的基因上的3个位点，分别是psen1基因上的rs165932位点，psen2基因上的rs8383位点，app基因的rs466448位点，同时，本发明选取与晚发型相关的基因apoe上的rs7412和rs429358位点，以上述5个位点为检测位点。

4、基于上述位点，本发明的提供一种检测阿尔兹海默病基因的核酸组合。

5、根据本发明具体实施方式的检测阿尔兹海默病基因的核酸组合，其包括用于检测5个基因多态性位点的扩增引物和延伸引物，上述扩增引物和延伸引物各自对应检测的基因名称和snp位点如表1所示：

6、

7、用于扩增rs7412位点的上游引物，其核苷酸序列如seq id no.1所示：

8、5'-acgttggatgtaagcggctcctccgcgat-3'；

9、用于扩增rs7412位点的下游引物，其核苷酸序列如seq id no.2所示：

10、5'-acgttggatacgcggccctgttccaccag-3'；

11、用于对rs7412位点进行单碱基延伸的延伸引物，核苷酸序列如seq id no.3所示：

12、5'-atgccgatgacctgcagaag-3'；

13、用于扩增rs429358位点的上游引物，其核苷酸序列如seq id no.4所示：

14、5'-acgttggattcggaactggaggaacaact-3'；

15、用于扩增rs429358位点的下游引物，其核苷酸序列如seq id no.5所示：

16、5'-acgttggatcagctcctcggtgctctg-3'；

17、用于对rs429358位点进行单碱基延伸的延伸引物，其核苷酸序列如seq id no.6所示：

18、5'-gcgcggacatggaggacgtg-3'；

19、用于扩增rs165932位点的上游引物，其核苷酸序列如seq id no.7所示：

20、5'-acgttggattgaaacgctttttccagctctca-3'；

21、用于扩增rs165932位点的下游引物，其核苷酸序列如seq id no.8所示：

22、5'-acgttggatttcagttccgataaattctac-3'；

23、用于对rs165932位点进行单碱基延伸的延伸引物，其核苷酸序列如seq id no.9所示；

24、5'-ctgattactaattcaatatc-3'；

25、用于扩增rs8383位点的上游引物，其核苷酸序列如seq id no.10所示：

26、5'-acgttggatacaggaagcacagcaggttt-3'；

27、用于扩增rs8383位点的下游引物，其核苷酸序列如seq id no.11所示：

28、5'-acgttggatggaactggcttttcctctcc-3'；

29、用于对rs8383位点进行单碱基延伸的延伸引物，其核苷酸序如seq id no.12所示：

30、5'-ctgagaaggtcagattaggg-3'；

31、用于扩增rs466448位点的上游引物，其核苷酸序列如seq id no.13所示：

32、5'-acgttggatcatgccactttctcctggat-3'；

33、用于扩增rs466448位点的下游引物，其核苷酸序列如seq id no.14所示：

34、5'-acgttggatgggctgtggcttggtaacta-3'；

35、用于对rs466448位点进行单碱基延伸的延伸引物，其核苷酸序列如seq id no.15所示：

36、5'-tgctctagaactgcccagat-3' 。

37、在本发明中，扩增引物是用于多重pcr扩增，需要在一个反应管中同时扩增5个靶点，因此其中一个靶点的扩增势必会影响其他靶点的扩增，所以要通过引物设计以及反应条件的优化来提高扩增效率，而不是在同一反应管中将所有引物和模板简单的混合。

38、本发明经过多次实验验证与优化获得了上述扩增引物，其具有特异性好，扩增效率高的特点。

39、本发明在设计扩增引物的时候，避开了同源序列设计引物，特别是rs7412和rs466448有一段11bp的碱基同源，rs7412与rs429358两个突变位点相差137bp的碱基，为了保证每个位点都有较高的扩增效率，每个位点设计了独立的特异性引物，让pcr产物的长度尽可能的短。

40、第二方面，本发明提供了一种检测试剂盒，其包括上述核酸组合，优选的，所述试剂盒为基于飞行时间核酸质谱技术检测阿尔兹海默病基因的试剂盒。

41、在一些实施例中，上述试剂盒包括5重pcr预混液；5重pcr预混液中包括上述核酸组合中的扩增引物。

42、在一些实施例中，多重pcr预混液中还含有dntp mix；

43、在一些实施例中，多重pcr预混液中还含有mg2+、pcr缓冲液和dna聚合酶；

44、在一些实施例中，mg2+以mgcl2的形式添加至多重pcr预混液中；

45、在一些实施例中，dna聚合酶可以为taqdna聚合酶；

46、在一些实施例中，上述试剂盒中还包括iplex延伸预混液；

47、在一些实施例中，iplex延伸预混液中包括延伸引物组；

48、在一些实施例中，iplex延伸预混液中还包括iplex缓冲液、iplex终止混合液和iplex酶；

49、在一些实施例中，上述试剂盒还包括sap消化预混液，sap消化预混液含有sap缓冲液和sap酶，sap酶消化除去多余的酶、buffer、mg2+、dntp；

50、第三方面，本发明还提供了一种基于飞行时间核酸质谱技术检测阿尔兹海默病基因的方法，使用上述核酸组合或上述试剂盒进行检测。

51、在一些实施例中，为了增加引物的扩增效率，跨内含子设计引物，选用合适的dna聚合酶，本发明优化了在扩增过程中mgcl2的浓度，以及 dntp的比例浓度，最终使得5个位点的扩增效率和延伸效果达到最优。

52、在一些实施例中，多重pcr的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，45个循环；72℃延伸2min。

53、在一些实施例中，sap酶消化的反应程序为：37℃保温40min；85℃保温5min。

54、在一些实施例中，单碱基延伸的反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，52℃退火5s，80℃延伸5s，共40个循环，每个循环中插入退火和延伸5个循环；最后72℃后延伸3min。

55、在一些实施例中多重基因检测具有反应体系复杂，产物种类多样化和易导致交叉污染等特点，使用dp-tof飞行时间质谱仪进行基因检测，需要进行加样、多重pcr、sap消化、单碱基延伸、转板撕膜和芯片点样后上机检测的步骤。

56、本发明的有益效果：

57、本发明选择5个基因位点，通过设计覆盖5个位点的多重pcr引物和单碱基延伸引物，可在一个反应体系内同步实现5个目的靶点的扩增检测，具有特异性好，扩增效率高的特点。

58、本发明提供的核酸组合可以与基质辅助激光解离吸附飞行时间质谱技术相结合，能够简便、准确、高效地检测阿尔兹海默病基因上5个位点的snp分型，保证检测结果准确可靠，满足临床需求。将一代测序的结果与飞行时间核酸质谱做对比，5个snp位点的测序结果与飞行时间核酸质谱检测结果一致，从而，本发明的检测方法准确可靠。从而，在获得基因型的检测结果后，医生结合临床指标，便于进行进一步进行综合的判断。