一种DNA功能化的MOF及其制备方法和应用

本发明涉及一种dna功能化的mof及其制备方法和应用，属于抗生素检测领域。

背景技术：

1、随着全球人口的快速增长，频繁的农业和工业活动中各种抗生素的含量大幅增加，这将对环境和人类健康产生灾难性的影响。在各种抗生素中，四环素因其对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物具有抗菌活性而被广泛用于饲料动物和人类传染病的治疗。由于其相对较低的成本和广泛的抗菌活性，四环素也被广泛用作食品添加剂，导致其在乳制品、土壤、废水中产生残留物。四环素残留的积累可对人体健康造成严重威胁，包括肾损伤、耳部损伤和胃肠道反应。为了保护人类健康和生态环境，需要灵敏的分析工具来监测食品、药品制剂和水中的四环素残留量。到目前为止，传统的四环素分析方法，如高效液相色谱(hplc)，毛细管电泳(ce)，色谱和电化学技术，仍存在着需要昂贵而复杂的设备，需要繁琐的准备步骤等弊端。因此，迫切需要开发简单，快速的传感方法，用于定量检测四环素。

2、纳米或微容器是一种多功能结构，含有孔隙或空腔，用于捕获小分子和引入特定功能，在药物输送、生物医学、生物反应器和生物传感领域有许多应用。通过利用核酸适体编码的结构和功能信息，并将其用作看门人，开发适配体功能化的纳米或微型容器已经成为一种新趋势。同时，dna过氧化物酶模拟酶(dnazyme)作为一种新型的生物催化剂逐渐引起学者的广泛关注。此外，将比色信号与其他传感方式相结合，集成功能化金属-有机框架纳米容器和高效dna纳米酶的可视化多模式四环素传感平台的可行性研究相对较少。因此，简单、灵敏的高效dna纳米酶催化辅助可视化多模式传感器在抗生素检测方面具有诱人的潜力。

技术实现思路

1、发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种将hemin和aunps包埋进mof材料中，采用dna链组成的生物门协助完成控释，通过比色和sers信号的变化定量检测四环素的方法。

2、技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供一种dna功能化的mof，所述dna功能化的mof为mof@hemin/aunps@cdna/ssdna，所述mof@hemin/aunps@cdna/ssdna是将mil-101-nh2与cdna连接得到mof-cdna，然后将hemin和aunps包埋进mof-cdna的孔隙中，再将ssdna与cdna杂交得到dna功能化的mof，所述cdna序列如seq id no.1所示，所述ssdna是四环素特异性适配体与g4-dna形成的双链dna，所述四环素特异性适配体的序列如seq idno.2所示，所述g4-dna的序列如seq id no.3所示。

3、本发明还提供了一种所述dna功能化的mof的制备方法，包括以下步骤：

4、步骤(1)：mofs有机框架纳米容器(mil-101-nh2)的制备：采用溶剂热法合成了具有高比表面积和高孔隙率的纳米容器，均匀的孔道结构为载体提供了合适空间，丰富的氨基基团为表面功能化提供了界面活性位点；将2-氨基对苯二甲酸二甲酯和fecl3·6h2o加入到dmf中，进行反应，冷却至室温，过滤，分别用n,n-二甲基甲酰胺和乙醇洗涤，干燥，得到mil-101-nh2；

5、步骤(2)：叠氮化物功能化mof和互补dna功能化mof的合成：通过氨基缩合作用分别在叠氮化物功能化mof的表面组装互补dna网络层，并使用pbs定容，形成互补dna功能化mof,于4℃冰箱备用。将步骤(1)中所述mil-101-nh2加入到四氢呋喃中，依次加入叔丁基亚硝酸盐和叠氮基三甲基硅烷，室温孵育过夜，得到mil-101-n3；加入到二苄基环辛基功能化cdna(序列为3′gca tgc ctt aag cga tcg ggg gcc tcc ggt gcc tga acc caa cca tggtgc tcg agg tcg gct agg tcg gtg cac-5′)的水溶液中，加热搅拌，分次加入nacl，用pbs溶液洗涤，得到互补dna功能化mof；

6、步骤(3)：hemin包埋以及cdna/ssdna门控mof的合成：hemin为血红蛋白的可见光吸收单元和催化辅因子，利用hemin作为客体分子或有机连接剂来组装mof，可以将hemin和mofs的独特性质结合起来，克服hemin在生理条件下容易自聚集、自猝灭等缺点；将步骤(2)中所述互补dna功能化mof与aunps、hemin混合，加入由四环素特异性适配体(序列为5′cgtacg gaa tetracycline gct agc ccc cgg agg cca cgg act tgg gtt ggt acc acg agctcc agc cga tcc agc cac gtg-3′)和g4-dna(序列为5′tgg gta ggg cgg gtt ggg aaattt ttt tgg gta ggg cgg gtt ggg aaa ttt ttt tgg gta ggg cgg gtt ggg aaa tttttt-3′)组成的ssdna与cdna杂交形成杂交双链，离心清洗，得到mof@hemin/aunps@cdna/ssdna；

7、步骤(4)：靶诱导cdna/ssdna功能化mof的解锁和血红蛋白的释放：将步骤(3)中所述mof@hemin/aunps@cdna/ssdna重悬于pbs溶液中；加入四环素，离心后得到所述dna功能化的mof。

8、本发明还提供了一种由所述方法构建的dna功能化mof。

9、本发明还提供了一种利用所述dna功能化mof检测四环素浓度的方法，包括以下步骤：将待测溶液中加入到na2edta-mcilvaine缓冲液和三氯乙酸中，利用所述dna功能化mof进行sers-比色检测；当四环素存在时溶液有sers信号和紫外吸光度变化，四环素的浓度越高sers信号的强度越大，紫外吸光值也越高。

10、其中，所述四环素的浓度为10-4-10μg/ml。

11、本发明还提供了一种sers-比色可视化多模式四环素检测方法：收集的上清含有血红素和ssdna，在室温下保存1小时以组装dnazyme。然后加入h2o2孵育20min，再加入草酸钛钾溶液，记录吸光度信号，并采集体系sers光谱。根据不同浓度的抗生素标准液所对应的sers强度信号特征值以及吸光度值，分别绘制出四环素浓度相关标准曲线。

12、本发明还提供了由所述方法制备的基于功能化金属-有机框架纳米容器和高效dna纳米酶的可视化多模式四环素传感平台。

13、本发明还提供了所述基于功能化金属-有机框架纳米容器和高效dna纳米酶的可视化多模式四环素传感平台在检测四环素含量中的应用：取牛奶样本加入一定量四环素，然后加入三氟乙酸，经过除杂、去蛋白质、去脂肪、离心、旋转蒸发、过膜、复溶等一系列预处理操作，得到样品液；测定样品液的sers强度信号特征值以及吸光度值，根据步骤五所得的四环素检测标准曲线，计算牛奶样本中四环素的含量，以及加标回收率。

14、优选的，所述叠氮化物功能化mof(mil-101-n3)具有良好的稳定性，无毒、绿色经济等显著性优势，高孔隙率、大表面积、均匀可调谐的纳米结构空腔和良好的生物相容性，可以明显提高催化辅因子(hemin)的固定量，丰富的氨基基团使其更易功能化，提高了适配体结合效率。

15、优选的，所述三价dna过氧化物酶模拟酶(dnazyme)，作为传统纳米酶的理想替代品，dnazyme具有优越的催化活性、稳定性。该酶三维结构的高表面积含有大量暴露的活性位点，显著提高了质量/电子转移效率，克服了传统的纳米酶技术面临着固有的活性位点不确定性、晶体面和尺寸依赖性等巨大的挑战。

16、优选的所述适配体门控分子是指人工合成的单链非编码dna或rna序列，它们能够以极好的亲和力选择性地与目标结合。与传统的识别元件抗体相比，适体具有体积小、特异性和稳定性高、非免疫原性和修饰可控等优点，为实现特异性检测提供了有力支撑。

17、优选的，步骤(1)中所述fecl3·6h2o、2-氨基对苯二甲酸二甲酯和dmf的摩尔质量和体积比为2mmol:1.5～3mmol:30ml。

18、优选的，步骤(1)中所述反应的温度为150～160℃，时间为20～24h。

19、优选的，步骤(2)中所述mil-101-nh2和四氢呋喃的质量体积比为20mg:5～7ml。

20、优选的，步骤(2)中所述叔丁基亚硝酸盐和叠氮三甲基硅烷的体积比为1.5ml：1.4～1.5ml。

21、优选的，步骤(2)中所述mil-101-n3和cdna水溶液的质量体积比为5mg：5～6ml，所述cdna水溶液的浓度为20nmol/ml。

22、优选的，步骤(2)中所述加热的温度为38～43℃，时间为70～74h。

23、本发明原理：首先合成mil-101-nh2，连接cdna，随后将hemin和aunps包埋进mof-cdna的孔隙中并连接ssdna，完成传感平台构建。当四环素存在时，ssdna与四环素结合，ssdna从mil-101-nh2上脱落并释放出hemin和aunps，采集体系的sers光谱，然后离心收集上清液加入h2o2和草酸钛钾溶液，检测溶液的吸光度值。本发明的难点在于将hemin和aunps包埋进mof材料中，采用dna链组成的生物门协助完成控释，通过比色和sers信号的变化定量检测四环素。

24、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

25、1、首次合成具有高孔隙率和均匀孔径的功能化mof叠氮化物(mil-101-n3)，通过优化反应配比及响应时间，具有超高负载能力以及控释效率；

26、2、与同等尺寸的非功能化mof颗粒相比，适配体功能化mof具有更好的稳定性；

27、3、dna过氧化物酶模拟酶(dnazyme)作为一种新型的生物催化剂，具有独特的高效催化能力、不易失活、无毒、绿色经济、生物相容性等显著性优势；

28、4、所述适配体门控分子是指人工合成的单链非编码dna或rna序列，它们能够以极好的亲和力选择性地与目标结合；

29、5、与传统的识别元件抗体相比，适配体具有体积小、特异性和稳定性高、非免疫原性和修饰可控等优点，为实现特异性检测提供了有力支撑。