针对人PD-L1和PD-L2的双重特异性抗体及其使用方法

本公开内容总体上涉及医学、肿瘤学和免疫学领域。更特别地，其涉及与pd-l1和pd-l2结合的双特异性人抗体及其在癌症治疗中的用途。

背景技术：

1、对t细胞共抑制受体pd-1与其配体pd-l1的相互作用的阻断已经成为现代肿瘤学的支柱，这现今对于一些黑素瘤和肺癌患者亚群而言甚至可在一线环境中实现(boussiotis,2016)。许多靶向pd-1或pd-l1的抗体目前已被fda批准或处于临床试验中；然而，尚无靶向第二pd-1配体，pd-l2的药剂在临床研究之中。pd-l2与pd-l1相比以高约3倍的亲和力与pd-1结合，并且像pd-l1一样，发送减弱t细胞功能的抑制信号(cheng et al.,2013；latchman et al.,2001；lee et al.,2016；li et al.,2017；youngnak et al.,2003)。历史上，认为pd-l2多是表达局限于肿瘤基质的诱导型共抑制分子；然而，改进的pd-l2检测试剂揭示了在肿瘤微环境中和肿瘤细胞自身上均存在广泛pd-l2表达(baptista etal.,2016；danilova et al.,2016；derks et al.,2015；dong et al.,2016；howitt etal.,2016；kim et al.,2015；kim et al.,2015；nomi et al.,2007；obeid et al.,2016；ohigashi et al.,2005；roemer et al.,2016；shi et al.,2014；shin et al.,2015；xuet al.,2016)。最近，已表明pd-l2在多种癌症中是针对pd-1抗体派姆单抗(pembrolizumab)的响应的独立预测因子(yearley et al.,2017)。

2、首次在大多数经典型霍奇金淋巴瘤(classical hodgkin’s lymphoma，chl)中描述，染色体区域9p24.1的扩增导致pd-l1和pd-l2(其存在于染色体区域9p24.1中)直接上调，以及通过增强jak2活性间接诱导(roemer et al.,2016；shi et al.,2014；green etal.,2010；van roosbroeck etal.,2016)。除chl之外，高pd-l1/pd-l2共表达的这种遗传驱动也见于大多数原发性纵隔大b细胞淋巴瘤(primary mediastinal large b-celllymphoma，pmbl)、t细胞淋巴瘤以及多种组织细胞和树突细胞恶性病中。并不意外地，这些癌症中的许多已显示对pd-1阻断作出响应。最近，在例如三阴性乳腺癌(triple-negativebreast cancer，tnbc)的实体瘤中已证实了9p24.1扩增(howitt et al.,2016；barrett etal.,2015)。相对高的pd-l1和pd-l2共表达也已在多种其他癌症中观察到，例如胃癌、黑素瘤、鳞状肺癌、头颈癌、宫颈癌和外阴癌、膀胱癌和肝细胞癌，等等(baptista et al.,2016；danilova et al.,2016；derks et al.,2015；dong et al.,2016；howitt et al.,2016；kim et al.,2015；nomi et al.,2007；obeid et al.,2016；xu et al.,2016；yearley etal.,2017；van roosbroeck et al.,2016；barrett et al.,2015；shin et al.,2016；inoue et al.,2016；wang et al.,2011)。除这些肿瘤本身的表达之外，已记载这些肿瘤中的许多具有pd-l2的基质和内皮表达(yearley et al.,2017)。这些发现表明pd-l1阻断在这些癌症中的治疗性潜力受到限制。

3、pd-1共抑制受体主要由活化的t细胞和nk细胞表达，并且因此可最好地被与之结合并防止pd配体接合的抗体靶向。相比之下，pd-l1由肿瘤细胞和抑制性基质群体表达，并且可被能够进行细胞毒性效应物功能的抗体靶向。尽管可在体外表明这些有抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，adcc)能力的pd-l1抗体的理论优势，但尚不存在患者数据证实在患者中具有实际的效应物功能或相对于纯阻断型变体而言改善结局(boyerinas et al.,2015)。

4、pd-l1和pd-l2仅共有约40％的同一性，因为其各自与不同于pd-1的另外的受体结合(latchman et al.,2001)。pd-l1还以另外的负t细胞调节相互作用与b7-1结合(butteet al.,2007；butte et al.,2008)。在小鼠中，pd-l2可与骨髓细胞或者t细胞上的rgmb结合，并调节对吸入抗原的耐受(xiao et al.,2014；nie et al.,2017)。在肿瘤中pd-l2与rgmb结合的作用有待描述，这种相互作用在人中的相关性也如此。从治疗观点来看，可表明具有针对pd-l1和pd-l2的双特异性抗体是极其有利的。

技术实现思路

1、因此，根据本公开内容，提供了选择性地与pd-l1和pd-l2二者结合的抗体或抗体片段，其具有分别来自表3和表4的克隆配对的重链和轻链cdr序列。所述抗体或抗体片段可由表1中所示的克隆配对的可变序列编码，可由与表1中所示的克隆配对的可变序列具有70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变序列编码，或者可由与表1中所示的克隆配对序列具有95％或更大同一性的轻链和重链可变序列编码。所述抗体或抗体片段可包含根据来自表2的克隆配对序列的轻链和重链可变序列，可包含与来自表2的克隆配对序列具有70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变序列，或者可包含与来自表2的克隆配对序列具有95％或更大同一性的轻链和重链可变序列。

2、还提供了在对象中治疗癌症的方法，其包括使对象中的pd-l1或pd-l2阳性癌细胞与如上所述的抗体接触。pd-l1或pd-l2阳性癌细胞可以是实体瘤细胞，例如肺癌细胞、脑癌细胞、头颈癌细胞、乳腺癌细胞、皮肤癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、子宫癌细胞、宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞、食管癌细胞、淋巴瘤细胞、肾细胞癌细胞，或者可以是白血病或骨髓瘤，例如急性髓细胞白血病、慢性髓细胞源性白血病或多发性骨髓瘤。

3、该方法还可包括使pd-l1或pd-l2阳性癌细胞与第二抗癌剂或抗癌治疗例如化学治疗、放射治疗、免疫治疗、激素治疗或毒素治疗接触。第二抗癌剂或抗癌治疗可抑制胞内pd-l1或pd-l2功能。第二抗癌剂或抗癌治疗可与第一药剂同时给予，或者在第一药剂之前和/或之后给予。pd-l1或pd-l2阳性癌细胞可以是转移性癌细胞、多重抗药性癌细胞或复发性癌细胞。

4、抗体可以是单链抗体、单域抗体、嵌合抗体或fab片段。抗体可以是人抗体、鼠抗体、igg、人源化抗体或人源化igg。抗体或抗体片段还可包含标记，例如肽标签、酶、磁性颗粒、发色团、荧光分子、化学发光分子或染料。抗体或抗体片段还可包含与其连接的抗肿瘤药物，例如通过光不稳定的接头或可酶促切割接头与抗体或抗体片段连接的抗肿瘤药物。抗肿瘤药物可以是毒素、放射性同位素、细胞因子或酶。抗体或抗体片段可与纳米粒或脂质体缀合。

5、在另一个实施方案中，提供了在对象中治疗癌症的方法，其包括向对象递送具有分别来自表3和表4的克隆配对的重链和轻链cdr序列的抗体或抗体片段。抗体片段可以是重组scfv(单链可变片段(single chain fragment variable))抗体、fab片段、f(ab’)2片段或fv片段。抗体可以是igg。抗体可以是嵌合抗体。递送可包括抗体或抗体片段施用，或用编码所述抗体或抗体片段的rna或dna序列或载体进行遗传递送。

6、抗体或抗体片段可由表1中所示的克隆配对的轻链可变序列和重链可变序列编码，可由与表1中所示的具有95％同一性的克隆配对的轻链和重链可变序列编码，以及可由与来自表1的克隆配对序列具有70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变序列编码。抗体或抗体片段可包含根据来自表2的克隆配对序列的轻链和重链可变序列，可包含与来自表2的克隆配对序列具有70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变序列，或者可包含与来自表2的克隆配对序列具有95％同一性的轻链和重链可变序列。

7、还提供了单克隆抗体，其中抗体或抗体片段以分别来自表3和表4的克隆配对的重链和轻链cdr序列为特征。抗体片段可以是重组scfv(单链可变片段)抗体、fab片段、f(ab’)2片段或fv片段。抗体可以是嵌合抗体或igg。

8、抗体或抗体片段可由表1中所示的克隆配对的轻链和重链可变序列编码，可由与表1中所示的具有95％同一性的克隆配对的轻链和重链可变序列编码，以及可由与来自表1的克隆配对序列具有70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变序列编码。抗体或抗体片段可包含根据来自表2的克隆配对序列的轻链和重链可变序列，可包含与来自表2的克隆配对序列具有70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变序列，或者可包含与来自表2的克隆配对序列具有95％同一性的轻链和重链可变序列。

9、在另一个实施方案中，提供了编码抗体或抗体片段的杂交瘤或经改造的细胞，其中所述抗体或抗体片段以分别来自表3和表4的克隆配对的重链和轻链cdr序列为特征。抗体片段可以是重组scfv(单链可变片段)抗体、fab片段、f(ab’)2片段或fv片段。抗体可以是嵌合抗体或igg。

10、抗体或抗体片段可由表1中所示的克隆配对的轻链和重链可变序列编码，可由与表1中所示的具有95％同一性的克隆配对的轻链和重链可变序列编码，以及可由与来自表1的克隆配对序列具有70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变序列编码。抗体或抗体片段可包含根据来自表2的克隆配对序列的轻链和重链可变序列，可包含与来自表2的克隆配对序列具有70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变序列，或者可包含与来自表2的克隆配对序列具有95％同一性的轻链和重链可变序列。

11、另一个实施方案包括含有一种或更多种抗体或抗体片段的癌症疫苗，所述抗体或抗体片段以分别来自表3和表4的克隆配对的重链和轻链cdr序列为特征。至少一种抗体片段可以是重组scfv(单链可变片段)抗体、fab片段、f(ab’)2片段或fv片段。至少一种抗体可以是嵌合抗体或igg。至少一种抗体或抗体片段可由表1中所示的克隆配对的轻链和重链可变序列编码，可由与表1中所示的具有95％同一性的克隆配对的轻链和重链可变序列编码，以及可由与来自表1的克隆配对序列具有70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变序列编码。至少一种抗体或抗体片段可包含根据来自表2的克隆配对序列的轻链和重链可变序列，可包含与来自表2的克隆配对序列具有70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变序列，或者可包含与来自表2的克隆配对序列具有95％同一性的轻链和重链可变序列。

12、在另一个实施方案中，提供了在对象中检测表达pd-l1或pd-l2的细胞的方法，其包括：使来自所述对象的样品与以分别来自表3和表4的克隆配对的重链cdr序列和轻链cdr序列为特征的抗体或抗体片段接触，以及通过使所述抗体或抗体片段与所述样品中的细胞结合来检测所述样品中表达pd-l1或pd-l2的细胞。样品可以是体液或组织样品。细胞可以是癌细胞，例如淋巴瘤细胞、乳腺癌细胞或肾细胞癌细胞。细胞可以是与免疫抑制相关的细胞。与免疫抑制相关的细胞可以是在肿瘤微环境中的非癌细胞，例如基质细胞或内皮细胞。检测可包括elisa、ria或western印迹。该方法还可包括再次进行该方法，并确定与第一次测定相比正痘病毒(orthopoxyvirus)抗原水平的变化。抗体或抗体片段可由表1中所示的克隆配对的轻链可变序列和重链可变序列编码，可由与表1中所示的具有95％同一性的克隆配对的轻链和重链可变序列编码，以及可由与来自表1的克隆配对序列具有70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变序列编码。抗体或抗体片段可包含根据来自表2的克隆配对序列的轻链和重链可变序列，可包含与来自表2的克隆配对序列具有70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变序列，或者可包含与来自表2的克隆配对序列具有95％同一性的轻链和重链可变序列。

13、可预期的是，本文中所述的任何方法或组合物可相对于本文中所述的任何其他方法或组合物来实施。通过以下详细描述，本公开内容的其他目的、特征和优点将显而易见。然而，应理解的是，详细描述和具体实例尽管指出了本公开内容的一些具体实施方案但是仅以举例说明的方式给出，因为根据该详细描述，在本公开内容的精神和范围内的多种改变和修改对于本领域技术人员将显而易见。

14、如本文中使用的“基本上不含”就指定组分而言在本文中用于意指该指定组分未被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以微量(trace amount)存在。由组合物的任何意外污染引起的指定组分的总量优选低于0.01％。最优选的是其中用标准分析方法不能检测到指定组分的量的组合物。

15、如本文在说明书和权利要求书中所使用的，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或更多个/种。如本文在说明书和权利要求书中所使用的，当与词语“包含/包括”联合使用时，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或多于一个/种。如本文中所使用，在说明书和权利要求书中，“另一”或“又一”可意指至少第二个/种或更多个/种。

16、如本文在说明书和权利要求书中所使用的，术语“约”用于指示：值包括用于确定所述值而使用的装置、方法之误差的固有变化，或者在研究对象之间存在的变化。

17、通过以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将显而易见。然而，应理解的是，详细描述和具体实例尽管指出了本发明的一些实施方案但是仅以举例说明的方式给出，因为根据该详细描述，在本发明的精神和范围内的多种改变和修改对于本领域技术人员将显而易见。