用于非洲猪瘟病毒重组毒株、Ⅰ型及Ⅱ型毒株鉴别的双重荧光定量PCR组合物及试剂盒的制作方法

本发明属于病毒检测，尤其涉及用于非洲猪瘟病毒重组毒株、ⅰ型及ⅱ型毒株鉴别的双重荧光定量pcr组合物及试剂盒。

背景技术：

1、非洲猪瘟(african swine fever，asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fevervirus，asfv)引起的家猪和野猪的一种急性传染病，具有呼吸系统障碍、神经系统症状和全身出血等特征。它的临床表现为发热、呼吸困难、咳嗽、拉稀、神志不清等，病程短促而病死率极高。asfv可通过直接接触、食入受污染的饲料和水源等方式在猪群中快速传播，一旦发生疫情，病猪数量会在短时间内急剧增加。

2、目前，asf对全球养猪业造成了巨大损失，许多国家和地区的养猪业都曾遭遇过asf疫情，导致大量猪只死亡。2018年我国首次发生ii型asf疫情，之后在我国呈广泛流行态势，由于没有有效的疫苗和治疗药物，非洲猪瘟给养猪业带来重大经济损失。2021年，我国首次报道分离出两株与nh/p68和ourt88/3高度相似的基因ⅰ型弱毒株，感染猪只都没有明显的临床症状和病毒血症，给临床的诊断和疫情的防控带来了极大的困难。

3、2023年，哈尔滨兽医研究所赵东明研究员带领的团队报道了3株ⅰ型和ii型的重组非瘟毒株，该重组毒株在猪中不仅具有更高致死率和传染性，而且还具有极强的免疫逃逸能力，无疑又加剧了asf防控难度。因此，开发出一种快速、准确、灵敏的鉴别非洲猪瘟重组毒株、ⅰ型毒及ⅱ型毒株的检测方法是目前急需解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于非洲猪瘟病毒重组毒株、ⅰ型及ⅱ型毒株鉴别的双重荧光定量pcr组合物、试剂盒及其检测方法。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种用于同时鉴定和检测非洲猪瘟病毒重组毒株、ⅰ型及ⅱ型毒株的组合物，所述组合物由mgf_110-1l的引物和探针以及o61r的引物和探针组成；

4、所述mgf_110-1l的上游引物序列如seq id no.1所示，所述mgf_110-1l的下游引物序列如seq id no.2所示；

5、所述mgf_110-1l的探针序列如seq id no.3所示；

6、所述mgf_110-1l的探针的5'荧光基团为fam，所述mgf_110-1l探针的3'荧光基团为bhq1；

7、所述o61r的上游引物的序列如seq id no.4和所述o61r的下游引物的序列如seqid no.5所示；

8、所述o61r的探针序列如seq id no.6所示；

9、所述o61r的探针的5'荧光基团为vic，所述o61r的探针的3'荧光基团为bhq1。

10、第二方面，本发明提供了一种用于同时鉴定和检测非洲猪瘟病毒重组毒株、ⅰ型及ⅱ型毒株的双重荧光定量pcr试剂盒，所述双重荧光定量pcr试剂盒包括：mgf_110-1l的引物和探针、o61r的引物和探针、2×aceq universal u+probe master mix v2和ddh2o。

11、优选地，所述双重荧光定量pcr试剂盒的反应体系为：

12、2×aceq universal u+probe master mix v210ul，

13、mgf_110-1l上游引物0.2ul，

14、mgf_110-1l下游引物0.2ul，

15、mgf_110-1l探针0.1ul，

16、o61r上游引物0.2ul，

17、o61r下游引物0.2ul，

18、o61r探针0.1ul，

19、样品总dna4ul，

20、ddh2o5 ul；

21、所述mgf_110-1l的上游引物序列如seq id no.1所示，所述mgf_110-1l的下游引物序列如seq id no.2所示；

22、所述mgf_110-1l的探针序列如seq id no.3所示；

23、所述mgf_110-1l的探针的5'荧光基团为fam，所述mgf_110-1l探针的3'荧光基团为bhq1；

24、所述o61r的上游引物的序列如seq id no.4和所述o61r的下游引物的序列如seqid no.5所示；

25、所述o61r的探针序列如seq id no.6所示；

26、所述o61r的探针的5'荧光基团为vic，所述o61r的探针的3'荧光基团为bhq1。

27、优选地，所述双重荧光定量pcr试剂盒的反应条件为：37℃2min；95℃5min；95℃10s，60℃30s，40个循环。

28、优选地，所述双重荧光定量pcr试剂盒的检测结果判定标准为：

29、当fam通道ct<40且有明显扩增曲线，但vic通道没有ct时，检测样品的检测结果判定为非洲猪瘟病毒ⅰ型；

30、当fam通道无ct，但vic通道ct<40且有明显扩增曲线时，检测样品的检测结果判定为非洲猪瘟病毒ⅱ型；

31、当fam通道ct<40且有明显扩增曲，并且vic通道ct<40且有明显扩增曲线时，检测样品的检测结果判定为非洲猪瘟重组毒株。

32、第三方面，本发明提供了一种用于同时鉴定和检测非洲猪瘟病毒重组毒株、ⅰ型及ⅱ型毒株的双重荧光定量pcr检测方法，所述双重荧光定量pcr检测方法包括如下步骤：

33、(1)获取检测样品dna；

34、(2)配置双重荧光定量pcr反应体系，按照设定的反应条件进行双重荧光定量pcr反应；(3)根据判定标准判定检测样品的毒株类型；

35、所述双重荧光定量pcr检测方法用于非疾病诊断。

36、优选地，所述双重荧光定量pcr反应体系如下：

37、2×aceq universal u+probe master mix v210ul，

38、mgf_110-1l上游引物0.2ul，

39、mgf_110-1l下游引物0.2ul，

40、mgf_110-1l探针0.1ul，

41、o61r上游引物0.2ul，

42、o61r下游引物0.2ul，

43、o61r探针0.1ul，

44、样品总dna4ul，

45、ddh2o5 ul；

46、所述mgf_110-1l的上游引物序列如seq id no.1所示，所述mgf_110-1l的下游引物序列如seq id no.2所示；

47、所述mgf_110-1l的探针序列如seq id no.3所示；

48、所述mgf_110-1l的探针的5'荧光基团为fam，所述mgf_110-1l探针的3'荧光基团为bhq1；

49、所述o61r的上游引物的序列如seq id no.4和所述o61r的下游引物的序列如seqid no.5所示；

50、所述o61r的探针序列如seq id no.6所示；

51、所述o61r的探针的5'荧光基团为vic，所述o61r的探针的3'荧光基团为bhq1。

52、优选地，所述双重荧光定量pcr反应的反应条件如下：37℃2min；95℃5min；95℃10s，60℃30s，40个循环。

53、优选地，所述判定标准为：

54、当fam通道ct<40且有明显扩增曲线，但vic通道没有ct时，检测样品的检测结果判定为非洲猪瘟病毒ⅰ型；

55、当fam通道无ct，但vic通道ct<40且有明显扩增曲线时，检测样品的检测结果判定为非洲猪瘟病毒ⅱ型；

56、当fam通道ct<40且有明显扩增曲，并且vic通道ct<40且有明显扩增曲线时，检测样品的检测结果判定为非洲猪瘟重组毒株。

57、本发明的有益效果在于：

58、本发明设计了能鉴别和检测非洲猪瘟病毒重组毒株、i型和ii型毒株的引物和探针，并且通过本发明所提供的双重荧光pcr可以快速、准确地鉴别和检测非洲猪瘟病毒的不同基因型，为asfv的流行病学调查和防控提供了有力工具；

59、其次，本发明的双重荧光pcr检测方法检测灵敏度高，能够检测到2.95×10-1copies的模板量，且本发明所提供的方法特异性好，仅检出目标病毒，对其他猪源病毒和阴性对照均无扩增。

60、同时，本发明所提供的方法重复性好，组内变异系数为0.23％-0.51％，组间变异系数为0.12％-0.4％。