检测人类线粒体全基因组的试剂盒及其使用方法与流程

本发明属于分子生物学，涉及适用于高通量测序的试剂盒，具体为检测人类线粒体全基因组的试剂盒及其使用方法。

背景技术：

1、法医检材纷繁复杂，常规的str分型系统不能在每次刑事案件勘查与侦破中都发挥着决定性作用，一些较为陈旧或严重降解的dna物证，检测核dna分型往往无法得到准确的结果。应用线粒体dna(mitochondrial dna,mtdna)则可能从环境破坏的dna中获得遗传分型信息。mtdna是人体细胞中唯一存在的核外遗传物质，为一条环状双链的dna分子，包含16569个碱基对(basepair,bp)，相对于核dna，mtdna的优点在于：(1)具有更高的拷贝数，广泛存在于各种细胞、组织，因此相比于核dna，mtdna的检测要容易许多；(2)遵循母系遗传且不存在基因重组，故在母系亲属关系鉴定中发挥着无可替代的作用；(3)高突变率，大约为核dna的10倍以上。这些突变能在较短时间内积累，构成了mtdna多态性的基础，增加了mtdna遗传标记的信息量和分辨率；(4)稳定性好，不易受降解dna分子中核酸外切酶的影响，在法医学检验中能保持分子完整性。因此，mtdna在法医学领域，母系亲缘关系鉴定以及疑难生物检材的个体识别具有独到之处和不可替代的作用。

2、在法医学领域，mtdna的传统检测方法以第一代测序技术，也称桑格尔测序(sanger sequencing)为基础，通过pcr长片段扩增后，在高精度电泳仪上分离、检测荧光信号进行定序，最后通过大量人工进行数据拼接，该方法对检材要求高、费用昂贵、数据分析复杂、特殊区域测序效果不佳。第二代测序技术(next generation sequencing,ngs)，也称高通量测序技术，它以dna合成为基础，通过文库制备、测序平台检测、实时数据分析，一次可对多个样本的几十万到几百万条dna分子进行序列测定，实现高通量并行测序，且随着高通量测序成本的不断降低，mtdna全基因组测序及分析将成为法医mtdna鉴定的必然趋势。

3、目前市面上已经商品化的mtdna全基因组测序试剂盒包括基于thermofisherscientific的iontorrent平台的precision id mtdna whole genome panel，以及基于illumina测序平台的forenseqtm mtdna whole genome kit，国产商品化试剂盒的选择则相对匮乏，尽管国内已有个别采用mtdna全基因组检测解决法医学案件的报道，但依赖进口试剂盒也意味着成本偏高，会限制mtdna全基因组检测在国内的推广。

技术实现思路

1、解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，获得一种适用于高通量测序技术，且特异性高，有效降低检测脱靶概率，一次性准确获得人类线粒体全基因组信息的产品；鉴于此，本发明提供了检测人类线粒体全基因组的试剂盒及其使用方法。

2、技术方案：检测人类线粒体全基因组的试剂盒，所述试剂盒包括143对扩增人类线粒体基因组全环的特异性扩增引物，143对引物序列的核苷酸序列如seq id no.1～seq idno.321所示。

3、优选的，所述143对引物序列扩增的片段在线粒体基因组全环上的位置分别为：第1对为1～182bp，第2对为113～341bp，第3对为258～461bp，第4对为410～597bp，第5对为514～708bp，第6对为618～793bp，第7对为721～898bp，第8对为805～988bp，第9对为926～1101bp，第10对为1001～1180bp，第11对为1116～1291bp，第12对为1220～1396bp，第13对为1301～1485bp，第14对为1410～1598bp，第15对为1515～1694bp，第16对为1616～1801bp，第17对为1695～1896bp，第18对为1825～2001bp，第19对为1904～2080bp，第20对为2004～2191bp，第21对为2103～2278bp，第22对为2205～2382bp，第23对为2303～2493bp，第24对为2420～2597bp，第25对为2510～2698bp，第26对为2621～2798bp，第27对为2707～2882bp，第28对为2824～3001bp，第29对为2910～3093bp，第30对为3012～3196bp，第31对为3113～3294bp，第32对为3201～3381bp，第33对为3312～3497bp，第34对为3446～3620bp，第35对为3516～3691bp，第36对为3620～3795bp，第37对为3704～3890bp，第38对为3802～3985bp，第39对为3919～4163bp，第40对为4011～4199bp，第41对为4104～4279bp，第42对为4222～4399bp，第43对为4345～4585bp，第44对为4502～4678bp，第45对为4613～4798bp，第46对为4719～4943bp，第47对为4884～5124bp，第48对为5048～5281bp，第49对为5202～5387bp，第50对为5303～5481bp，第51对为5426～5598bp，第52对为5519～5699bp，第53对为5616～5799bp，第54对为5701～5884bp，第55对为5814～5994bp，第56对为5908～6091bp，第57对为6005～6201bp，第58对为6124～6301bp，第59对为6226～6401bp，第60对为6318～6493bp，第61对为6448～6639bp，第62对为6584～6771bp，第63对为6721～6896bp，第64对为6801～6986bp，第65对为6904～7098bp，第66对为7017～7254bp，第67对为7205～7381bp，第68对为7311～7497bp，第69对为7401～7600bp，第70对为7543～7762bp，第71对为7704～7893bp，第72对为7817～7997bp，第73对为7901～8141bp，第74对为8081～8309bp，第75对为8206～8382bp，第76对为8325～8559bp，第77对为8511～8686bp，第78对为8623～8845bp，第79对为8802～8977bp，第80对为8919～9095bp，第81对为9017～9197bp，第82对为9125～9291bp，第83对为9225～9401bp，第84对为9303～9478bp，第85对为9402～9587bp，第86对为9503～9679bp，第87对为9609～9787bp，第88对为9723～9898bp，第89对为9825～10001bp，第90对为9918～10101bp，第91对为10007～10190bp，第92对为10126～10301bp，第93对为10201～10378bp，第94对为10323～10498bp，第95对为10423～10655bp，第96对为10609～10784bp，第97对为10703～10914bp，第98对为10825～11000bp，第99对为10950～11164bp，第100对为11120～11297bp，第101对为11221～11399bp，第102对为11304～11494bp，第103对为11403～11592bp，第104对为11523～11701bp，第105对为11607～11782bp，第106对为11722～11897bp，第107对为11834～12063bp，第108对为12008～12196bp，第109对为12101～12301bp，第110对为12203～12386bp，第111对为12312～12492bp，第112对为12445～12685bp，第113对为12626～12866bp，第114对为12819～12995bp，第115对为12909～13084bp，第116对为13023～13199bp，第117对为13108～13301bp，第118对为13202～13390bp，第119对为13317～13493bp，第120对为13414～13589bp，第121对为13514～13694bp，第122对为13617～13850bp，第123对为13804～13990bp，第124对为13935～14150bp，第125对为14103～14280bp，第126对为14216～14456bp，第127对为14375～14615bp，第128对为14532～14747bp，第129对为14669～14897bp，第130对为14810～14990bp，第131对为14920～15095bp，第132对为15003～15243bp，第133对为15161～15393bp，第134对为15331～15531bp，第135对为15401～15600bp，第136对为15545～15783bp，第137对为15707～15883bp，第138对为15824～16048bp，第139对为15942～16113bp，第140对为16061～16255bp，第141对为16189～16426bp，第142对为16327～16509bp，第143对为16431～47bp。

4、优选的，所述143对引物序列的扩增产物长度为160～250bp，且相邻两对引物获得的序列重叠40～150bp。

5、优选的，所述143对引物分为两组，其中，编号为奇数的特异性扩增引物为引物组a，编号为偶数的特异性扩增引物为引物组b。采用以上分组的目的在于：满足叠瓦式扩增需要，即两个相邻扩增子a、b，其位置有部分重叠，即第b扩增子的前引物会位于a扩增子的前、后引物之间，如果不分组，b的前引物和a的后引物会形成一个较短的、优势扩增的片段，会影响叠瓦扩增覆盖目标区间的范围。

6、具体的引物序列及引物组如表1所示：

7、表1特异性扩增引物序列和对应引物组

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15、优选的，所述特异性扩增引物的浓度为0.01-0.1μm。

16、优选的，所述特异性扩增引物的5’端均连接有锚定序列，其中上游引物锚定序列为seq id no.322，下游引物锚定序列为seq id no.323。具体序列为：seq id no.322：cctacacgacgctcttccgatct，seq id no.323：ttcagacgtgtgctcttccgatct。

17、优选的，所述试剂盒包括反应混合液、阳性对照dna和测序接头；其中，反应混合液的组分及各组分的终浓度为：mgcl2、2-10mm，dntp、0.2-1mm，tris-hcl、10-100mm，taq dna聚合酶、1-5u，bsa、0.1-1mg/ml，甘油、0.01％-0.1％；阳性对照为0.5ng/μl 9948dna。

18、优选的，所述测序接头用于样本标记和测序，测序接头包括8种f序列和12种r序列，f序列和r序列组合使用。具体为：f序列任意一条与r序列任意一条组合，使用不同的组合可区分不同的样本。

19、优选的，所述测序接头及其序列分别为：f5001、seq id no.324；f5002、seq idno.325；f5003、seq id no.326；f5004、seq id no.327；f5005、seq id no.328；f5006、seqid no.329；f5007、seq id no.330；f5008、seq id no.331；r7001、seq id no.332；r7002、seq id no.333；r7003、seq id no.334；r7004、seq id no.335；r7005、seq id no.336；r7006、seq id no.337；r7007、seq id no.338；r7008、seq id no.339；r7009、seq idno.340；r7010、seq id no.341；r7011、seq id no.342；r7012、seq id no.343。测序接头具体序列信息如表2所示：

20、表2测序接头序列

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22、以上任一所述的检测人类线粒体全基因组的试剂盒的使用方法，所述方法包括以下步骤：

23、s1、目标片段扩增

24、以人类基因组dna为模版，采用特异性扩增引物进行扩增反应，在pcr仪中按以下程序扩增：95℃，10min；95℃，15s；60℃，60s；72℃，30s，18个循环；72℃，5min；

25、按以下体积比配制反应体系：

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27、s2、pcr产物纯化

28、采用磁珠法对pcr产物进行纯化，在s1的各反应产物中按pcr产物:纯化磁珠的体积比为5:7加入磁珠，混合均匀并室温静置后置于磁力架上，至澄清、弃上清；加入体积分数为80％的乙醇溶液，并保持在磁力架上室温静置、弃去乙醇，并重复该步骤一次；继续置于磁力架上，并完全去除残留乙醇，空气中干燥至磁珠刚刚出现龟裂；然后加入水混合均匀作为s3的模板使用；

29、s3、测序接头连接和目标片段富集

30、在s2纯化后的pcr产物中加入反应混合液、测序接头，短暂离心后置于pcr仪中按以下程序反应：95℃，10min；95℃，15s；66℃，60s；72℃，30s，15个循环；72℃，5min；

31、s4、文库纯化

32、采用磁珠分选法纯化s3的反应产物，向s3的反应产物中加入磁珠，混合均匀并室温静置后置于磁力架上，至澄清、弃上清；加入体积分数为80％的乙醇溶液，并保持在磁力架上室温静置、弃去乙醇，并重复该步骤一次；继续置于磁力架上，并完全去除残留乙醇，空气中干燥至磁珠刚刚出现龟裂；然后加入水混合均匀后室温放置至澄清，吸取澄清液至新的pcr管中，并置于-25～-15℃中保存；

33、s5、测序及数据分析

34、对文库进行定量后上机测序，并经数据分析软件进行数据比对，分析所检测的线粒体全基因组。

35、有益效果：(1)本发明所述试剂盒设计的143对特异性扩增引物可以高效地扩增整个人类线粒体基因组序列，每对引物的扩增产物长度在160～250bp，且相邻两对引物获得的序列重叠40～150bp，并在体系中加入简并引物，特异性高，可有效降低检测脱靶概率，因此可以一次性地准确地获得人类线粒体全基因组的信息。

36、(2)采用本发明的试剂盒及提供的操作步骤避免了复杂的、耗时较久的建库流程，非特异性片段少，适合进行大规模并行测定人类线粒体全基因组。

37、(3)采用本发明的试剂盒获得的样品线粒体全基因组高质量变异结果，可为亲缘关系鉴定提供关键线索。