水稻抗病蛋白RGA5-HMA120及其编码基因

本发明属于基因工程领域，涉及水稻抗病蛋白rga5-hma120及其编码基因。

背景技术：

1、植物病害是对作物生产的持续威胁，也是实现粮食安全的主要制约因素。稻瘟病由真菌病原体magnaporthe oryzae引起，是对全球水稻生产最大的收获前生物威胁(deanet al.,2012；liu et al.,2014；pennisi,2010)。这种病害可导致每年损失足够21.12亿至7.42亿人食用的大米(fisher et al.,2012)，并导致受感染地区高达100％的产量损失(dean et al.,2012；liu et al.,2014)。水稻生产的可持续性至关重要，它是世界上一半以上人口的主要粮食作物。研究人员通过系统发育树分析和菌株间育性试验，成功地从水稻植株中分离了稻瘟病菌，并对其进行了病原学研究(couch&kohn,2002；ebbole,2007)。但由于真菌的适应性进化和变异，使得传统的育种方法和化学防治都无法控制这种病害(pennisi,2010)。因此，利用多系品种或广谱抗病基因等策略，以期获得水稻抗病持久性。

2、植物具有高效的内源免疫系统以抵御各种病原菌侵染，该免疫方式依赖于抗病蛋白特异性识别病原菌分泌的效应蛋白，进而引起局部细胞程序性死亡，也称为超敏反应(hypersensitive response,hr)(dodds&rathjen,2010)。目前，水稻中已经发现的抗病基因绝大多都是编码核苷酸结合结构域和富含亮氨酸重复序列的受体蛋白(nucleotide-binding domain,leucine-rich repeat containing receptors,nlrs)，nlrs可进一步分为tnls(toll/interleukin-1receptor nlrs)、cnls(coiled-coil nlrs)和rnls(rpw8-like coiled-coil nlrs)三类(jubic et al.,2019)。除了含有经典的cc/tir、nb-arc和lrr结构域外，许多nlrs中还存在一些非经典的结构域可以作为“诱饵”，直接识别病原菌无毒蛋白。这种识别模式被称为“整合诱饵(integrated decoy，id)”模型，常见于成对nlrs(paired nlrs)免疫受体复合物中，例如rga5和rga4(cesari et al.,2014)。rga4编码蛋白具有激活水稻病害抗性及诱导细胞死亡的功能，而rga5能够抑制rga4的活性。稻瘟病菌分泌的max类效应蛋白avr1-co39或avr-pia能够被rga5重金属结合区域(heavy metal-associated domain,hma)结构域识别，进而解除rga5对rga4的抑制作用，激活水稻免疫反应(césari et al.,2014)。稻瘟菌效应蛋白avr-pita含有典型锌金属蛋白酶结构域，属于非max类效应蛋白，田间常发生变异来逃脱pi-ta的识别，导致抗性丧失。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供水稻抗病蛋白rga5-hma120及其编码基因。

2、第一方面，本发明提供了蛋白质，命名为rga5-hma120，为如下a1)、a2)或a3)：

3、a1)由seq id no:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

4、a2)与a1)所示蛋白的氨基酸序列同源性大于99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上，且具有相同功能的蛋白；

5、a3)在a1)-a2)任一所述蛋白的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质。

6、第二方面，本发明提供了编码第一方面所述蛋白质的核酸分子。

7、上文所述核酸分子为如下任一种：

8、b1)编码序列是序列表中seq id no：1所示的dna分子；

9、b2)序列表中seq id no：1所示的dna分子；

10、b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码第一方面所述蛋白质的dna分子；

11、b4)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码第一方面所述蛋白质的dna分子。

12、第三方面，本发明提供了含有第二方面所述核酸分子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

13、第四方面，本发明提供了第一方面所述蛋白质的应用，为如下(c1)或(c2)或(c3)或(c4)：

14、(c1)结合稻瘟病菌的效应蛋白avr-pita；

15、(c2)识别稻瘟病菌的效应蛋白avr-pita后激活rga4引起的植物免疫反应；

16、(c3)调控水稻对于含有效应蛋白avr-pita的稻瘟病菌的免疫反应；

17、(c4)调控水稻对于含有效应蛋白avr-pita的稻瘟病菌的抗性。

18、上述调控为加强水稻对于含有效应蛋白avr-pita的稻瘟病菌的免疫反应，或加强水稻对于含有效应蛋白avr-pita的稻瘟病菌的抗性。

19、第五方面，本发明提供了第一方面所述的蛋白质，或，第二方面所述的核酸分子，或，第三方面所述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在水稻育种或水稻抗稻瘟病遗传改良中的应用。

20、上文所述应用中，所述育种的目的是为了选育对于含有效应蛋白avr-pita的稻瘟病菌具有抗性的水稻。

21、第六方面，本发明提供了如下方法a-d：

22、a、一种激活植物免疫反应的方法，包括如下步骤：将第二方面所述的核酸分子、水稻rga4蛋白的编码基因(genbank:ab604622.1，2011年6月14日)和稻瘟病菌的效应蛋白avr-pita的编码基因(seq id no:23)共同导入目的植物，激活目的植物的免疫反应；

23、b、一种加强水稻对于含有效应蛋白avr-pita的稻瘟病菌产生免疫反应的方法，包括如下步骤：将第二方面所述的核酸分子和水稻rga4蛋白的编码基因(genbank:ab604622.1，2011年6月14日)导入目的水稻，使目的水稻加强对于含有效应蛋白avr-pita的稻瘟病菌的免疫反应；

24、c、一种获得对含有效应蛋白avr-pita的稻瘟病菌具有抗性的水稻的方法，包括如下步骤：将第二方面所述的核酸分子和水稻rga4蛋白的编码基因(genbank:ab604622.1，2011年6月14日)导入目的水稻，使目的水稻获得对含有效应蛋白avr-pita的稻瘟病菌的抗性；

25、d、一种水稻育种方法，包括如下步骤：将方法c获得的水稻作为育种材料用于水稻育种。

26、上文中的目的水稻不含有rga4基因(或者rga4无功能)且不含有rga5基因，在本发明的实施例中以日本晴水稻为例。

27、在上述方法中，导入所述目的植物，具体可为：通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

28、所述目的植物可为烟草或水稻。

29、第六方面，本发明提供了第五方面所述的方法在水稻育种或水稻抗稻瘟病遗传改良中的应用。

30、本发明提出以rga5基因为基础，前期构建了水稻hma结构域酵母文库，对avr-pita进行酵母文库筛选，筛选到与avr-pita互作的hma120结构域，利用筛选到的hma120结构域对rga5所编码蛋白质碳末端的hma结构域进行结构域替换，获得了rga5基因突变体rga5-hma120。实验表明rga5-hma120所编码的蛋白质能够特异性识别稻瘟菌的非max效应蛋白avr-pita，以解除其对rga4基因的抑制作用，激活水稻体内的免疫反应，改变了其识别从而使含有该抗病基因的水稻获得了对含有avr-pita效应蛋白的稻瘟菌抗性。将rga5-hma120基因应用到水稻抗病品种改良可获得抗稻瘟病水稻品种。利用该思路可创制一系列遗传背景相同，但对不同稻瘟菌小种具有抗性的近等基因系水稻品种。通过将不同抗稻瘟病水稻品种进行田间混种，能够有效降低稻瘟病发病率，减少稻瘟菌变异几率，保持抗稻瘟病水稻品种的持久抗性。同时，通过近等基因系水稻品种田间混合种植将有效提高种植效率，便于田间水肥管理。综上所述，该发明对于水稻抗稻瘟病遗传改良及抗病品种选育具有重要意义。