一种固液相结合制备LHRH类似物的方法与流程

本发明属于多肽合成领域，特别涉及一种固液相结合制备lhrh类似物的方法。

背景技术：

1、黄体生成素(lh)和卵泡刺激素(fsh)是由垂体前叶释放出来的，受控于下丘脑产生的促黄体生成素释放激素(lhrh)，给药lhrh及其类似物可抑制性腺功能，可以治疗诸如子宫内膜异位、中枢性早熟、不育和前列腺癌等疾病。戈舍瑞林、布舍瑞林、亮丙瑞林、阿拉瑞林、德舍瑞林都是lhrh类似物。

2、瑞林类多肽的碳末端大多数为乙胺基、氨基脲，合成方式与普通肽稍有不同。cn107602668a中国专利文献报道了一种液相全合成制备布舍瑞林的方法，用boc和fmoc联合保护，将四肽h-d-ser(tbu)-leu-arg-pro-nhet与五肽h-pyr-his-trp-ser-tyr-nhnh2以酰基叠氮偶合方式全合成而成。

3、文献(biochemical and biophysical research communications 1978，vol 81，no2，page382-390)采用4+3+2片段缩合法合成瑞林类多肽，步骤如下：1、合成z-pro-x(x为azgly-nh2，-nhet)，然后合成二肽片段boc-arg(no2)-pro-x；2、合成z-tyr(bzl)-b-leu-ome(b为d-phe，d-ser(tbu))；3、合成pyr-a-trp-ser-ome(a为his，d-phe)。然后，通过酰基叠氮法先将二肽和三肽缩合成z-tyr(bzl)-b-leu-arg(no2)-pro-x，最后再次通过酰基叠氮法将五肽和四肽缩合成pyr-a-trp-ser-tyr(bzl)-b-leu-arg(no2)-pro-x。

4、虽然采用酰基叠氮法能够有效的抑制消旋，但是酰基叠氮过程中容易发生其他副反应，如trp容易被亚硝化，叠氮化物可能转换成相应的酰胺等。酰基叠氮法另一个显著的缺点是叠氮化物不稳定，叠氮化物curtius重排为异氰酸酯后，只需要稍微升高温度就会生成尿素和其他副产物，而且副产物很难和目标产物进行分离，因此，反应需在低温下进行，而且缩合时间长。

5、综上，叠氮法制备瑞林类多肽的杂质多，收率和纯度都比较低，而且反应条件比较苛刻，反应时间长，不利于产业化生产。因此，提供一种可减少杂质产生，显著提高合成收率和纯度的制备lhrh类似物的方法具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的杂质多、反应条件苛刻、反应时间长、收率和纯度低的问题，本发明提供了一种固液相结合制备lhrh类似物的方法，包括以下内容：

2、提供由固相合成得到的肽酰肼；

3、在亚硝基化合物和偶联剂条件下，将所述肽酰肼原位转化为其活性酯；

4、将所述活性酯与胺反应，得到lhrh类似物；

5、所述肽酰肼为h-pyr-his-trp-ser-tyr-x-leu-arg-pro-conhnh2；

6、所述lhrh类似物为h-pyr-his-trp-ser-tyr-x-leu-arg-pro-y；

7、其中，

8、x选自d-leu、d-ser(tbu)、d-ala、d-trp时，y选自-nhc2h5；

9、x选自d-ser(tbu)时，y选自-nhnhconh2。

10、在一些实施方案中，该方法用于结构为h-pyr-his-trp-ser-tyr-x-leu-arg-pro-y的lhrh类似物的合成，当x为d-leu，y为-nhc2h5时，所述lhrh类似物为亮丙瑞林；当x为d-ser(tbu)，y为-nhc2h5时，所述lhrh类似物为布舍瑞林；当x为d-ala，y为-nhc2h5时，所述lhrh类似物为阿拉瑞林；当x为d-trp，y为-nhc2h5时，所述lhrh类似物为德舍瑞林；当x为d-ser(tbu)，y为-nhnhconh2时，所述lhrh类似物为戈舍瑞林。

11、上述制备方法中，所述亚硝基化合物选自亚硝酸盐、亚硝酸酯。

12、优选地，所述亚硝酸盐选自nano2、kno2；所述亚硝酸酯选自亚硝酸叔丁酯、亚硝酸正丁酯、亚硝酸异丁酯、亚硝酸正戊酯、亚硝酸异戊酯。

13、上述制备方法中，所述偶联剂选自hosu、oxyma pure、hoat、hoct、hobt、6-cl-hobt、4-硝基苯酚、五氟苯酚。

14、hosu结构式为：

15、oxyma pure结构式为：

16、hoat结构式为：

17、hoct结构式为：

18、hobt结构式为：

19、6-cl-hobt结构式为：

20、4-硝基苯酚结构式为：

21、五氟苯酚结构式为：

22、上述制备方法中，制备亮丙瑞林、布舍瑞林、阿拉瑞林和德舍瑞林时，对应的活性酯与乙胺反应生成lhrh类似物；制备戈舍瑞林时，对应的活性酯与氨基脲反应生成lhrh类似物。

23、上述制备方法中，以羟基树脂制备肽酰肼主要包括以下步骤：

24、步骤1：羟基树脂经活化剂活化成活泼羰基树脂z-co-o-resin，其中z为活化基团；

25、步骤2：活泼羰基树脂z-co-o-resin与nh2nh2反应合成nh2nh-co-o-resin；或与fmoc-nhnh2反应合成fmoc-nhnh-co-o-resin，脱除fmoc得到nh2nh-co-o-resin；

26、步骤3：nh2nh-co-o-resin与保护氨基酸或保护肽片段按lhrh类似物的肽序偶联，形成全保护肽酰肼树脂；

27、步骤4：全保护肽酰肼树脂经裂解试剂裂解，得到肽酰肼h-pyr-his-trp-ser-tyr-x-leu-arg-pro-conhnh2。

28、优选地，步骤1中所述羟基树脂选自wang resin、hmba resin、hmpa resin。将羟基树脂活化之后，使其能够与肼反应得到活化后的活泼羰基树脂，以进行后续反应。活化后的活泼羰基树脂比羟基树脂具有更好的酸敏感性，能够在tfa体积分数为5％以上的tfa-dcm体系中发生断裂，且所选的羟基树脂价格低廉，储存稳定性高，活化树脂的步骤操作简单，临用前反应即可，有利于工业大规模生产。

29、优选地，步骤1所述活化剂选自光气、双光气、三光气、n，n'-羰基二咪唑、4-硝基苯基氯甲酸酯、n，n'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯。

30、在一些实施方案中，活化剂采用光气、双光气或三光气时，z为cl，即活化后的活泼羰基树脂为cl-co-o-resin，其结构具体为：

31、

32、在一些实施方案中，活化剂为n，n'-羰基二咪唑时，z为咪唑基，即活化后的活泼羰基树脂为咪唑基-co-o-resin，其结构具体为：

33、

34、在一些实施方案中，活化剂为4-硝基苯基氯甲酸酯时，z为4-硝基苯氧基，即活化后的活泼羰基树脂为4-硝基苯氧基-co-o-resin，其结构具体为：

35、

36、在一些实施方案中，活化剂为n，n'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯时，z为n-氧代丁二酰亚胺基，即活化后的活泼羰基树脂为n-氧代丁二酰亚胺基-co-o-resin，其结构具体为：

37、

38、上述结构式中，圆球均代表树脂。

39、上述制备方法中，以2-cl ctc树脂制备肽酰肼包括以下步骤：

40、步骤1：2-cl ctc树脂与nh2nh2反应合成nh2nh-2-cl ctc resin，或与fmoc-nhnh2反应合成fmoc-nhnh-2-cl ctc resin，脱除fmoc得到nh2nh-2-cl ctc resin；

41、步骤2：nh2nh-2-cl ctc resin与保护氨基酸或保护肽片段按lhrh类似物的肽序偶联，形成全保护肽酰肼树脂；

42、步骤3：全保护肽酰肼树脂经裂解试剂裂解，得到肽酰肼h-pyr-his-trp-ser-tyr-x-leu-arg-pro-conhnh2。

43、优选地，在制备戈舍瑞林或布舍瑞林的实施方案中，裂解试剂采用tfa、tis、dcm的混合溶液，且三者体积比为(5～20):(5～10):(70～90)。通过控制酸的浓度，可确保树脂及保护基团裂解的同时d-ser(tbu)上的tbu基团保留。同时，由于肽酰肼在水中的溶解性好，全保护肽酰肼树脂裂解后得到的肽酰肼可直接用水进行抽提，无需使用乙醚、异丙醚等沉降剂进行沉降，节省了操作步骤，提高了生产效率，降低了成本，绿色环保。

44、上述制备方法中，合成肽酰肼所用的保护氨基酸选自fmoc-arg-oh、fmoc-arg-oh·hf、fmoc-arg-oh·hcl、fmoc-arg-oh·hbr、fmoc-arg-oh·cf3cooh、fmoc-arg-oh·tosoh、fmoc-arg-oh·1/2h2so4。使用未保护的或者质子化的胍基代替有保护基的胍基，如fmoc-arg(pbf)-oh或者fmoc-arg(no2)-oh，可以避免脱除胍基保护基时所需的高浓度酸环境或者催化氢化反应，降低工业生产的反应难度以及安全隐患。

45、有益效果：与现有技术相比，本发明采用固相合成得到肽酰肼，在亚硝基化合物和偶联剂条件下进行反应，生成的中间体酰基叠氮化合物会迅速与作为质子供体的偶联剂反应转化为稳定的活化酯结构，活化酯进一步与胺进行反应，生成lhrh类似物。一方面，本发明保持了酰基叠氮化法的优点，如目标产物消旋杂质少，合成中使用最少侧链保护；另一方面，本发明避免了酰基叠氮化合物直接参与反应，从而避免了其苛刻的反应条件，室温条件下就可以完成反应；另外还有，得到的活化酯结构稳定，反应条件温和，使得其与胺反应的偶联产率更高、反应速度更快，降低了杂质的含量，提高了收率和纯度。除此之外，肽酰肼在水中溶解度好，全保护肽酰肼树脂裂解后得到的肽酰肼可直接用水进行抽提，无需使用乙醚、异丙醚等沉降剂，降低了成本，绿色环保。而且，制备戈舍瑞林和布舍瑞林可共用同一肽酰肼前体，可以简化不同肽的生产工艺。