一种清香型白酒细菌快速检测DNAMarker、试剂盒及方法和应用与流程

本发明涉及微生物分子生态学检测，具体涉及一种清香型白酒细菌快速检测dnamarker、试剂盒及方法和应用。

背景技术：

1、酒醅细菌在白酒生产中起着关键作用，一是参与白酒生产主要代谢途径；二是增加白酒风味；三是丰富白酒活性成分。

2、细菌在白酒生产中是有机酸的主要产生菌，可合成内源性酶蛋白参与催化反应，甚至能与酵母发生相互作用形成一定的风味物质。清香型白酒发酵阶段包括大茬发酵和二茬发酵两个阶段，不同发酵阶段的发酵工艺均存在差异。因此，不同发酵条件下酒醅中微生物群落结构存在差异，对酒的品质也会造成一定的影响。在发酵前半程(2-15d)是微生物繁殖阶段，芽孢杆菌和酵母是主要的影响因素；发酵后半程(15-30d)是风味物质合成阶段，乳酸菌是主要影响因素。乳酸菌起着重要的作用，既调节着微环境，影响其他功能微生物的繁殖，又对酯类、醇类、酸类等风味物质的合成有贡献。以汾酒酿造的两大重要环节—制曲和发酵为突破点，认识酿造微生物群体生态特征，寻找关键功能微生物，对于丰富中国白酒的酿造科学理论和实现白酒现代化生产具有重要的意义和价值。

3、现在多采用实时荧光定量pcr和高通量测序探究不同环境细菌群落的丰度、多样性、组成和结构，实时荧光定量pcr检测细菌受制于：所需试剂价格昂贵，实验使用次数少，无法做到批量检测鉴定细菌。基因测序虽然操作简便，但存在的问题是测序成本贵，测序错误率高，同时依赖大型科研仪器与专业的生物信息分析人员，并且检测周期也比较长。而生产工过程调控又要求快速检测微生物的动态变化，以便掌握发酵状态并制定相应的调控策略。目前，仍然缺乏快速、准确检测微生物的动态变化的方法。

4、目前缺乏汾酒酿造过程中适合于细菌群落的快速检测方法。因此，建立适用于中国白酒酿造环境中细菌菌群结构的快速检测的试剂盒及方法，有助于深入解析细菌对白酒品质的作用，为明确白酒中功能微生物、监控白酒生产过程、优化生产菌种组合提供技术支持。

技术实现思路

1、为提供一种适用于酿酒过程的细菌群落的快速检测方法，本发明提供了一种清香型白酒细菌快速检测dna marker、试剂盒及方法和应用，本发明提供的dna marker是通过其物种特异性序列(16s rdna的可变区v3区)来精准表征样品dna所属的菌属地位，marker的每条组成条带都为单一序列，代表特定的菌种，结果可靠，特异性好，灵敏度高、安全、直观、多个样本可同时分析并体现各样本的差异。

2、本发明提供了一种清香型白酒细菌快速检测dna marker，所述dna marker的核苷酸序列分别如seq id no.3-seq id no.50所示。

3、进一步地，所述dna marker中seq id no.3-seq id no.50依次指示的菌为lactobacillus plantarum、weissella paramesenteroides、lactobacillusacetotolerans、acetilactobacillus jinshanensis、lactobacillus futsaii、pediococcus pentosaceus、levilactobacillus zymae、lacticaseibacillusmanihotivorans、bacillus licheniformis、staphylococcus gallinarum、latilactobacillus curvatus、pediococcus clausenii、aristida congesta、rodentibacter heylii、uncultured cyanobacteriales、uncultured enterobacter、uncultured bacterium、uncultured clostridium、acetobacter pasteurianus、uncultured streptomyces、streptomyces ablus、saccharopolyspora rectivirgula、lactiplantibacillus plantarum、latilactobacillus curvatus、pediococcusclausenii、aristida congesta、rodentibacter heylii、uncultured cyanobacteriales、uncultured enterobacter、uncultured bacterium、uncultured clostridium、acetobacter pasteuriams、uncultured streptomyces、streptomyces ablus、saccharopolyspora rectivirgula、bacterium enrichment、levilactobacillus brevis、lactobacillus crispatus、latilactobacillus curvatus、lactobacillus ponits、uncultured bacterium、lactobacillus kefiri、bacillus paralicheniformis、pediococcus parvulus、bacillus和lentilactobacillus camelliae。

4、本发明还提供了一种包含所述的清香型白酒细菌快速检测dna marker的试剂盒。

5、进一步地，所述试剂盒还包括引物组、pcr缓冲液和ste缓冲液。

6、进一步地，所述引物组包括核苷酸序列如seq id no.1-seq id no.2所示的片段。

7、进一步地，所述pcr缓冲液包括5μl 10×easy taq buffer，4μl 10mmol/ldntps，1μl上游引物，1μl下游引物，1μltaq酶，1.5μldna片段，36.5μlddh2o。

8、进一步地，所述ste缓冲液是由0.584g的nacl、0.12g的tris和0.37g的edta溶解于100ml的双重蒸馏水配制而成的。

9、本发明还提供了一种清香型白酒细菌快速dna marker的制备方法，包括如下步骤：

10、提取清香型白酒酒醅中微生物的基因组dna，以提取的微生物基因组dna为模板，以核苷酸序列如seq id no.1-seq id no.2所示的片段为引物，第一次pcr扩增16s rdnav3区序列，dgge分析，回收16s rdna v3区dna片段；

11、分别以细菌16s rdna v3区dna片段为模板，以seq id no.1-seq id no.2所示的片段为引物，进行第二次pcr扩增，分别回收细菌16s rdna v3区dna片段的第二次pcr扩增产物；

12、分别将第二次pcr扩增产物克隆到t载体上并转入感受态细胞，筛选阳性克隆子，提取质粒，dgge分析，验证条带在dgge胶片上的位置，筛选条带在dgge图谱上与模板条带电泳行为一致的质粒；

13、将所有在dgge图谱上与模板条带电泳行为一致的质粒混合获得混合质粒，以混合质粒为模板，以seq id no.1-seq id no.2所示的片段为引物，进行第三次pcr扩增，获得的第三次pcr产物与6×dna loading buffer混合均匀，即获得dnamarker。

14、本发明还提供了一种利用所述dna marker检测清香型白酒中细菌的方法，包括如下步骤：

15、提取待测样品微生物基因组总dna；

16、以待测样品微生物基因组总dna为模板进行pcr扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；

17、琼脂糖凝胶电泳结束后，将含有dna条带的凝胶放入2.5×4s red plus染液中染色15分钟，拍照进行分析对比，当待测样品中的某一条带与dna marker中条带在dgge凝胶上处于同一水平位置时，说明待测样品中含有dna marker条带所示细菌；当待测样品没有条带或条带与dna marker中条带在dgge凝胶上不处于同一水平位置时，说明测样品没有和标准条带相对应的细菌。

18、进一步地，以超纯水为模板获得的扩增产物作为阴性对照，以dna marker为模板获得的扩增产物作为待测样品对比的标准。

19、本发明还提供了一种所述的dnamarker在清香型白酒细菌检测中的应用。

20、进一步地，所述dna marker由xm1、xm2、xm3和xm4组成，使用时同时加入单独泳道作为标准。

21、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

22、1、本发明提供的dna marker是通过其物种特异性序列(16s rdna的可变区v3区)来精准表征样品dna所属的菌属地位，marker的每条组成条带都为单一序列，代表特定的菌种，仅限于在变性梯度凝胶电泳中使用。与现有技术相比本发明具有以下优点：结果可靠，特异性好，灵敏度高、安全、直观、多个样本可同时分析并体现各样本的差异。在实验耗材上，价格低，同时实验技术易普及，操作简单。与一般检测方法相比，为一种高效快速经济便捷的检测方法。