基于pH敏感型连接单元的可逆终止核苷酸的合成及其用途

本发明属于化学合成和生物化学领域，涉及可用于dna合成测序的化合物，涉及一类ph敏感型可逆终止核苷酸的合成及其用途，具体涉及一类基于ph敏感型连接单元的可逆终止核苷酸的合成及其在dna测序中的应用。

背景技术：

1、dna测序技术是现代生物学研究中重要的手段之一。人类基因组计划完成后，dna测序技术得到了迅速发展。dna测序(dnasequencing)是指分析特定dna片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)与鸟嘌呤(g)的排列方式。发展精确、高通量、低成本的dna测序方法对于生物、医药科学等具有非常重要的意义。

2、合成法测序(sequencing by synthesis,sbs)是新一代dna测序技术之一。合成法测序方法通过把大量被测的模板dna片段进行固定，并在固定化的dna测序模板上杂交结合通用的dna引物，分别控制四种核苷酸在dna引物上的延伸。通过检测延伸反应过程或延伸核苷酸，实现高通量并行的dna序列信息的检测。

3、在合成法测序中，首先要合成dna链延伸所需要的四色荧光标记四种不同碱基的核苷酸，即可逆终止核苷酸(reversible terminator)。早期的可逆终止核苷酸，除了要求3′-羟基阻断外，为了不影响下一个可逆终止核苷酸的延伸与识别，还要求通过一个可裂解连接单元把核苷酸和荧光素连接起来。然后，在下一个可逆终止核苷酸并入之前，在温和的条件下使这个连接单元断裂，继续dna链的延长，从而读出dna碱基的序列。该连接单元对合成法测序的读长和效率有重要的影响，因此，人们也一直致力于发展新的可裂解连接单元，来提高dna测序的效率。目前已报道的连接单元有还原剂敏感(二硫键,偶氮化合物)；光裂解(邻硝基苄基衍生物，苯甲酰甲基酯衍生物及光裂解连接单元)；亲电子试剂/酸敏感(酸裂解；叠氮化合物)；金属作用下的裂解；氧化剂敏感等。

4、可裂解连接单元对dna测序的读长和效率有重要的影响，而现有的连接单元存在裂解条件不够温和、裂解效率不高，用于测序时读长太短等缺点，因此，设计、合成新的可裂解连接单元，并探索合适的裂解条件对于提高测序的效率、发展新的测序方法有非常重要的意义。发明人在前期工作中，发展了一种三氮烯连接单元可用于dna合成测序(申请号：201410203327.9)。但是该类连接单元的可逆终止核苷酸在连接单元断裂后dna链上保留的残基过大，限制了dna测序时的读长。所以设计、合成断裂后残基保留少，并且残基对后续dna延伸影响小的连接单元用于dna测序,具有非常重要的意义。

5、后来发明人发展了基于三氮烯的无痕连接单元可逆终止核苷酸(发明专利202011286386.9)用于dna测序，从理论上讲，该类可逆终止核苷酸几乎是完美的，但是事实上却存在一系列缺点，首先dna延伸产物断裂时，有副反应发生，反应不够干净彻底，导致在实际测序过程中，读长与错误率都严重受限，并且在实验过程中我们发现这些副反应带来的影响实际上大于连接单元断裂后生成的残基的影响；其次专利202011286386.9所述化合物的合成难度很大，且产物很难纯化，需要反复多次hplc纯化才勉强得到可用的化合物。最后一点是以上两项专利所述化合物均需要在酸以及还原剂的共同作用下才能将连接单元断裂，而这一步的反应条件会导致可逆终止核苷酸以及待测模板dna损失很大，相当一部分核苷酸及模板被破坏。在这种情况下，我们发展了一类新型可逆终止核苷酸，只需要在酸性条件下，即可使连接单元断裂，反应干净彻底，几乎没有观察到副反应发生，且该类化合物合成简单方便，且可以大量合成。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一类基于ph敏感型连接单元的可逆终止核苷酸的合成及其用途。本发明设计合成的一类新的基于ph敏感型三氮烯连接单元的可逆终止核苷酸：其中为包含dutp,dctp,datp或dgtp核苷三磷酸的二级胺；r3是荧光染料，具体包括cy3，cy5,cy2,cy3.5,tamra,fitc,bdp fl,sulfo-cy3,sulfo-cy2,sulfo-cy5,sulfo-cy3.5等；linker为烷基链，聚乙二醇链等。该结构式的特点为使用特定结构的ph敏感型三氮烯连接单元将dntp和荧光素连接在一起形成可逆终止核苷酸。且该类化合物合成原料简单易得，合成过程均为常规化学反应，易于实现大量合成；该类化合物可与核苷酸和荧光素实现高效率的连接。通过研究该类化合物的裂解性能，发现该类化合物在弱酸性条件下可实现高效率断裂，具有应用于dna测序的价值。所以，基于三氮烯连接单元在dna测序体系中能够大大提高测序效率。

2、本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

3、第一方面，一种基于ph敏感型三氮烯连接单元的可逆终止核苷酸，其结构式如式(i)所示:

4、其中为包含dutp,dctp,datp或dgtp核苷三磷酸的二级胺；r3是荧光染料；linker为烷基链或聚乙二醇链。

5、作为本发明的一种实施方式，所述荧光染料选自cy3、cy5、cy2、cy3.5、tamra、fitc、bdp fl、sulfo-cy3、sulfo-cy2、sulfo-cy5或sulfo-cy3.5。

6、作为本发明的一种实施方式，所述烷基链为[ch2]n的烷基链,n＝1-20。

7、作为本发明的一种实施方式，所述聚乙二醇链为[ch2ch2o]nch2ch2的烷基链,n＝1-20。

8、第二方面，一种基于ph敏感型三氮烯连接单元的可逆终止核苷酸的合成方法，所述方法包括如下步骤：

9、s1、二氨基化合物和三氟乙酸乙酯反应得化合物al inker为烷基链或聚乙二醇链；

10、s2、化合物n-叔丁氧羰基氨基苯甲酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑在无水n,n-二甲基甲酰胺中反应后，依次加入无水三乙胺和化合物a，混合物室温下反应得化合物b

11、s3、在三氟乙酸的存在下，化合物b在适量二氯甲烷中反应去除boc保护基得到化合物

12、s4、将化合物c和氟硼酸溶解在乙醇中，缓慢滴加亚硝酸叔丁酯，滴加完成后反应得化合物d

13、s5、将包含dutp、dctp、datp或dgtp核苷三磷酸的二级胺化合物溶解在水中，加入适量碳酸氢钠后滴加溶解在乙腈中的化合物d，混合物反应后得化合物f

14、s6、将化合物f溶于适量氨水反应脱除三氟乙酰基得到化合物g

15、s7、化合物g使用荧光染料r3标记后得到所述可逆终止核苷酸。

16、作为本发明的一种实施方式，步骤s1中，二氨基聚乙二醇和三氟乙酸乙酯的摩尔比为1：1～10。

17、作为本发明的一种实施方式，步骤s1中，反应温度为25℃～-80℃。

18、作为本发明的一种实施方式，步骤s2中，n-叔丁氧羰基氨基苯甲酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑在25℃～-20℃条件下反应1h～24h。

19、作为本发明的一种实施方式，步骤s2中，n-叔丁氧羰基氨基苯甲酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑的摩尔比为1:1～10:1～10

20、作为本发明的一种实施方式，步骤s2中，n-叔丁氧羰基氨基苯甲酸、无水三乙胺和化合物a的摩尔比为1:1～100:1～10。

21、作为本发明的一种实施方式，步骤s2中，加入无水三乙胺和化合物a，混合物室温下反应1h～24h。

22、作为本发明的一种实施方式，步骤s3中，反应时间为1h～24h。

23、作为本发明的一种实施方式，步骤s4中，在25℃～-20℃的条件下，将化合物c和氟硼酸溶解在乙醇中。

24、作为本发明的一种实施方式，步骤s4中，滴加完成后25℃～-20℃反应1h～24h得化合物d。

25、作为本发明的一种实施方式，步骤s4中，化合物c、氟硼酸和亚硝酸叔丁酯的摩尔比为1:1～10:1～10。

26、作为本发明的一种实施方式，步骤s5中，在25℃～-20℃的条件下，将所述二级胺化合物溶解在水中。

27、作为本发明的一种实施方式，步骤s5中，混合物室温下反应1h～24h。

28、作为本发明的一种实施方式，步骤s5中，化合物e、碳酸氢钠和化合物d的摩尔比为1:1～100:1～10。

29、作为本发明的一种实施方式，步骤s6中化合物f溶于适量氨水反应1h～24h。

30、第三方面，本发明涉及一种前述的可逆终止核苷酸在dna测序中的用途。

31、本发明合成了一类新的可裂解连接单元，并合成了基于这种连接单元的可逆终止核苷酸；该类可逆终止核苷酸可用于dna合成测序。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

32、1)相对于201410203327.9中基于三氮烯连接单元的可逆终止核苷酸在断裂后dna链上保留的残基过大，限制了dna测序时的读长；本发明的可逆终止核苷酸在参与dna链延伸后，仅需在酸性条件下即可快速发生断裂；断裂后，残留在碱基上的二级胺基团较小，有利于dna合成测序的进行。

33、2)相对于202011286386.9中dna延伸产物断裂时，有副反应发生，反应不够干净彻底，导致在实际测序过程中，读长与错误率都严重受限，并且在实验过程中发现这些副反应带来的影响实际上大于连接单元断裂后生成的残基的影响；通过对产物的电泳和质谱分析，本发明的新型可逆终止核苷酸在dna合成测序及单分子测序中，连接单元能在5min内快速断裂，反应干净彻底，几乎没有观察到副反应发生。

34、3)相对于201410203327.9和202011286386.9中所述化合物均需要在酸以及还原剂的共同作用下才能将连接单元断裂，而这一步的反应条件会导致可逆终止核苷酸以及待测模板dna损失很大，在此过程中相当一部分核苷酸及模板被破坏；本发明的新型可逆终止核苷酸，只需要在酸性条件下，即可使连接单元断裂，反应干净彻底。

35、4)相对202011286386.9中化合物的合成难度很大，且产物很难纯化，需要反复多次hplc纯化才勉强得到可用的化合物；本发明的化合物合成所需原料简单易得，且可以大量合成，合成过程均为常规化学反应，可用于大规模推广使用，能够极大降低测序成本。