一种索马鲁肽的制备方法与流程

本发明涉及多肽合成，具体地，本发明涉及一种索马鲁肽的制备方法。

背景技术：

1、由于生活水平的提高，饮食结构和生活方式的改变等诸多因素，全球糖尿病发病率逐年增高，糖尿病已成为继肿瘤和心血管之后的第三大严重危害人类健康的疾病。尽管i型和ⅱ型糖尿病发病机理不同，但是他们都以持续的高血糖作为基本的生化特征。ⅱ型糖尿病人虽然自身能够产生胰岛素，但是由于胰岛素的抵抗使得自身对胰岛素的利用效果大打折扣，导致血糖升高。针对ⅱ型糖尿病的降糖药物包括二甲双胍类药物、磺酰脲类药物以及胰高血糖样肽-1(glp-1)的受体激动素类药物等，其中glp-1相关药物是近年来的研究热点。

2、索马鲁肽(semaglutide)是由诺和诺德公司研发的一种新的长效glp-1类似物，被用于改善ⅱ型糖尿病患者的血糖控制。通过每周皮下注射一次，可以实现患者血糖水平的大幅改善。除了在降血糖方面的有益功效，索马鲁肽在诱导减肥和减少患者重大心血管事件风险方面也有较好的临床效果。其中索马鲁肽的序列为:h-his-aib-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys(aeea-aeea-γ-glu-otc)-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-arg-gly-arg-gly-oh，分子式为c187h291n45o59，相对分子质量为4113.58，cas号为910463-68-2。

3、目前索马鲁肽的合成主要存在三种常规策略，包括：

4、策略一：通过基因重组技术，表达获得索马鲁肽主链第3-31或5-31片段，然后再分步连接上n端1-2或1-4片段和lys20位侧链长效修饰基团。原研厂家诺和诺德早期即采用该策略获得目标索马鲁肽产品。在该策略下，由于存在多个活性位点，使得此工艺会产生较多的杂质，并且工艺操作过于复杂，不利于低成本的大规模化生产。

5、策略二：采用全固相多肽合成技术。固相多肽合成存在的巨大优势便是操作简便，可机械化流程化，更利于规模化生产。例如专利us8129343、us8536122、cn108059666、cn103848910、cn108203462、cn108359006、cn108676087、cn109021092、cn109311961、cn108059666、cn109180801、cn111217901、cn101133082、cn106478806、cn106928343、cn104356224所涉及的内容。由于固相合成的特有优势，原研厂家也在该领域进行了专利布局(cn101133082)。尽管固相合成优势巨大，然而仍存在一些固有问题，包括：树脂替代值的限制、物料及溶剂的浪费和大量废液的产生。所有的这些问题，在工业化生产中都归结为成本较为高昂。

6、为了有效降低成本以及发挥固相合成优势，片段连接的方式成为可供选择的第三种策略。专利wo2016046753报道了多片段的固相合成及肽片段液相缩合来获取索马鲁肽主链的方法；专利cn106749613报道了三片段固液相结合策略来获取索马鲁肽的方法；专利cn109456401报道了液相合成六个主链片段，然后在固相上依次将6片段缩合上去获得索马鲁肽的方法；专利cn109627317和cn106749613分别报道了三片段[(1-12)+(13-24)+(25-31)]和[(1-16)+(17-22)+(23-31)]固液相结合获取索马鲁肽的方法。然而，三片段或更多片段的合成方法，需要制备更多的肽片段使得操作更为繁琐。

7、因此，亟需提供一种工艺简易、成本更低、产率高的索马鲁肽的制备方法。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提供一种索马鲁肽的制备方法。通过对索马鲁肽结构分析，将索马鲁肽分成大小相近的两片段，每一片段的氨基酸数目均在20个以内。这样既充分利用了固相多肽合成的优势，又保证了每一段多肽合成的产率。

2、为此，本发明第一方面提供一种索马鲁肽的制备方法，所述制备方法包括：

3、(1)固相合成获得全保护第一肽段和全保护第二片段，其中，

4、所述全保护第一肽段的氨基酸序列为nh2-his(r1)-aib-glu(r2)-gly-thr(r3)-phe-thr(r3)-ser(r3)-asp(r2)-val-ser(r3)-ser(r3)-tyr(r3)-leu-glu(r2)-gly-gln(r1)-ala-conhnh2；

5、所述全保护第二肽段的氨基酸序列为nh2-cys(r1)-lys[aeea-aeea-γ-glu(r2)-otc(r2)]-glu(r2)-phe-ile-ala-trp(r4)-leu-val-arg(r5)-gly-arg(r5)-gly-cooh；

6、其中，r1选自trt、mtt中的任意一种；

7、r2选自otbu、pnb、dmab、allyl中的任意一种；

8、r3选自tbu、trt、dmab中的任意一种；

9、r4选自boc、mts、alloc中的任意一种；

10、r5选自pbf、bis-boc、tfa、alloc中的任意一种；

11、(2)切割所述全保护第一肽段和全保护第二肽段获得第一肽段和第二肽段，其中，

12、所述第一肽段的氨基酸序列为：

13、nh2-his-aib-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-conhnh2；

14、所述第二肽段的氨基酸序列为：

15、nh2-cys-lys[aeea-aeea-γ-glu-otc]-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-arg-gly-arg-gly-cooh；

16、(3)将所述第一肽段、所述第二肽段混合，发生缩合反应，以便获得索马鲁肽中间体；

17、(4)对所述索马鲁肽中间体进行脱硫反应，得到脱硫液，获得索马鲁肽粗品；

18、(5)纯化索马鲁肽粗品，获得索马鲁肽纯品。

19、固相多肽合成具有操作简便，可机械化流程化的优势，而液相合成具有成本低，可规模化的优势。将固相合成和液相合成结合，发挥其各自的优势，在工业化生产中具有重要的意义。目前已报道的使用固液相策略的专利中，多采用全保护的三片段或更多片段的方法。全保护片段由于溶解性较差，使得难于操作，影响连接产率。

20、本发明提供了一种索马鲁肽的制备方法，该方法将索马鲁肽分成大小相近的两个片段，每一片段的氨基酸数目均在20个以内，对两个肽片段进行缩合反应，以制备索马鲁肽。这样既充分利用了固相多肽合成的优势，又保证了每一段多肽合成的产率。其中第一肽段构建了c端酰肼片段，第二肽段构建了n端cys片段，实现在水相体系中，两片段的选择性连接，最后经过脱硫处理，获得索马鲁肽。该方法解决了全保护肽片段的溶解性问题，实现了在水相体系中的两片段高效连接，既保证了产物的纯度、产率，又节省操作步骤，降低了成本。

21、根据本发明的实施例，步骤(1)进一步包括将保护基conhnh2预先构建于固相合成所述第一肽段时所使用的树脂中。其中所述保护基的后续活化过程及肽段的连接过程均不受侧链基团的任何影响，具有极好的正交性和后续多肽c端硫酯的高效获得性。

22、根据本发明的实施例，所述树脂包括选自2-cl-trityl resin、wang resin或sasrin resin。

23、根据本发明的实施例，步骤(1)进一步包括利用偶联试剂将氨基酸偶联到固相合成目标肽段时所使用的树脂。

24、根据本发明的实施例，所述偶联试剂独立地选自dic、edci、hatu、hctu、pyaop、pybop中的至少一种。

25、根据本发明的实施例，步骤(2)进一步包括利用切割试剂切割所述全保护第一肽段和全保护第二肽段，所述切割试剂包括tfa、edt、tips和水。

26、根据本发明的实施例，所述切割试剂中tfa、edt、h2o和tips的体积比为(85-97):(1-5):(1-5):(1-5)。由此保证切割效果。

27、根据本发明的实施例，步骤(3)进一步包括在所述第一肽段、所述第二肽段混合前，对所述第一肽段的c端进行活化处理。由此进一步提升缩合效率。

28、根据本发明的实施例，所述活化处理包括分别利用活化试剂和巯基试剂a对所述第一肽段的c端进行活化处理。

29、根据本发明的实施例，所述活化试剂包括亚硝酸盐。具体可选择亚硝酸钠、亚硝酸钾等亚硝酸盐，其可将c端酰肼基团转化为酰基叠氮基团。

30、根据本发明的实施例，所述利用活化试剂对所述第一肽段的c端进行活化处理的时间为5-60min。

31、根据本发明的实施例，所述巯基试剂a包括选自mpaa、mesna中的至少一种。其可所述巯基试剂a可使酰基叠氮基团转化为酰基硫酯。

32、根据本发明的实施例，所述利用巯基试剂a对所述第一肽段的c端进行活化处理的时间为5-60min。

33、根据本发明的实施例，步骤(3)中所述第一肽段和第二肽段的摩尔比为1:(1-2)。

34、根据本发明的实施例，所述缩合反应的时间为0.5-12h。

35、根据本发明的实施例，步骤(4)进一步包括利用脱硫试剂对所述索马鲁肽中间体进行脱硫反应。

36、根据本发明的实施例，所述脱硫试剂包括引发剂、还原试剂和巯基试剂b。

37、根据本发明的实施例，所述引发剂包括选自va044或四乙基硼酸钠。

38、根据本发明的实施例，所述还原试剂包括选自tcep或dtt。

39、根据本发明的实施例，所述巯基试剂b包括选自mesna、tbush和mtg中的至少一种。

40、根据本发明的实施例，所述索马鲁肽中间体、所述还原试剂、所述巯基试剂b与所述引发剂的摩尔比为1:(100-250):(10-100):(5-50)。

41、根据本发明的实施例，步骤(5)进一步包括利用高效液相色谱法对所述索马鲁肽粗品进行纯化。

42、本发明相对于现有技术具有以下有益效果：

43、(1)将固相合成和液相合成结合，既充分利用了两种合成方式的优势，又保证了每一段多肽合成的产率；

44、(2)通过构建c端酰肼片段与n端cys片段，实现在水相体系中，两片段的选择性连接，最后经过脱硫处理，获得索马鲁肽；

45、(3)该方法解决了全保护肽片段的溶解性问题，实现了在水相体系中的两片段高效连接，且产物纯度较高，仅通过一次纯化就可得到99％以上纯度。

46、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。