一种快速、定向创制早熟油菜的方法及鉴定该早熟油菜的引物对

本发明属于分子育种领域，涉及早熟油菜新品种的培育，特别是指一种快速、定向创制早熟油菜的方法及鉴定该早熟油菜的引物对。

背景技术：

1、油菜是中国主要种植的油料作物，也是世界上广泛种植的油料作物，在湖南的种植面积自2015年起便居全国第一位，是湖南省第二大作物。据统计，我国每年生产菜油约350万吨 ,占总食用植物油的三分之一以上，是最重要的油料作物之一。我国油菜产量位居世界前列，是我国优质食用油和饲用蛋白的主要来源之一。早熟油菜生育期短，开花早，可有效利用冬闲田，解决稻油轮作茬口矛盾，因此，培育早熟油菜对油菜产业发展具有重要的现实意义。

2、早花性状是研究油菜早熟的主要指标之一，作为植物开花路径中功能高度保守的开花基因，flc和tfl均被证实为植物开花负调控因子。flc 是一个mads-box 转录因子，可直接抑制ft 和soc1 等植物关键开花基因的表达，阻止顶端分生组织从营养生长向生殖生长的转换，抑制植物的开花，是一个植物开花关键负调控因子，在低温需求型植物中，flc的表达受到春化处理的抑制。tfl属于pebp基因家族，研究表明tfl基因调控植物花序发育和开花时间，在光周期诱导过程中抑制植物成花，为植物开花负调控因子。flc 同源基因在白菜、甘蓝和甘蓝型油菜等芸薹属作物中均有多个拷贝，其中白菜中有4 个，甘蓝中有5个，甘蓝型油菜中有9 个；tfl在甘蓝型油菜中也具有5个同源基因。由于甘蓝型油菜参考基因组等信息不够丰富，且bnaflc和bnatfl成员多，难以对所有的成员进行深入和系统的研究，因此其研究进展较为落后。专利cn 109112227 a公开了油菜开花关键基因作为油菜生态型改良和早熟育种的分子标记及应用，该发明针对bnaa10 .flc基因设计了分子标记用于辅助选择改良油菜花期。该专利实施例中记载了利用flc基因延长花期最初可延长20天以上，利用半冬性油菜中双11号的bnaa10.flc基因的分子标记可以提前获得早开花几天的油菜品种，该方法是通过杂交、连续回交合自交获得早开花或晚开花品种。为了进一步缩短油菜的开花周期，本课题组进行了长期的探索研究。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提出一种快速、定向创制早熟油菜的方法及鉴定该早熟油菜的引物对。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、一种快速、定向创制早熟油菜的方法，实验原理如下：

4、本技术通过一个载体同时靶向编辑油菜的9 个bnaflc或5个bnatfl基因并结合小孢子培养技术及分子标记以实现快速、定向地创造早熟油菜。我们观察了野生型植株及编辑植株生长发育情况，bnaflc或bnatfl编辑植株均出现早花早熟的现象，这表明了该方法的可行性。一方面，可在bnaflc或bnatfl突变后代中筛选出各个成员间的各种突变组合，f1代植株通过小孢子培养快速获得dh系，通过我们开发的分子标记辅助选择，即可在前期快速、定向地选择早熟油菜单株并制成需要的种质。

5、具体的，步骤如下：

6、（1）开花抑制基因的筛选及序列比对。筛选开花抑制基因bnaflc和bnatfl，进行序列比对，设计同时靶向9个bnaflc同源基因或5个bnatfl同源基因的grna序列；

7、（2）phse401-t1t2编辑载体构建：针对上述保守序列，通过在线网站crispr-pv2.0（http://crispr.hzau.edu.cn/crispr2/），在pam位点前各查询和选择两个能够同时定点靶向多个9个bnaflc(flc_target1和flc_target2）或5个bnatfl(tfl_target1和tfl_target2)同源基因的19bp保守序列，设为grna序列；根据grna序列设计引物组，以pcbc-dt1t2 质粒为模板，进行pcr反应并回收产物；

8、（3）将回收产物酶切克隆至phse401载体，获得phse401-t1t2载体，验证成功后转至农杆菌感受态细胞；

9、（4）经步骤（3）处理的农杆菌感受态细胞对受体品种的下胚轴进行侵染及共培养，获得t0代植株；

10、（5）t0代植株经过小孢子培养获得的纯系品种即为早熟油菜品种。

11、上述步骤（1）中同时靶向9个bnaflc同源基因的grna序列包括flc_target1和flc_target2，flc_target1的序列如seq id no.1所示、flc_target2的序列如seq id no.2所示，其中ngg为pam位点。

12、上述步骤（1）中同时靶向5个bnatfl同源基因的grna序列包括tfl_target1和tfl_target2，tfl_target1的序列如seq id no.3所示、tfl_target2的序列如seq id no.4所示，其中ngg和ccn为pam位点。

13、上述步骤（2）中与靶向9个bnaflc同源基因的grna序列相对应的引物组包括flc-dt1-bsf、flc-dt2-bsr、flc-dt1-f0和flc-dt2-r0，flc-dt1-bsf序列如seq id no.5所示、flc-dt2-bsr序列如seq id no.6所示、flc-dt1-f0序列如seq id no.7所示、flc-dt2-r0序列如seq id no.8所示。

14、上述步骤（2）中与靶向5个bnatfl同源基因的grna序列相对应的引物组包括tfl-dt1-bsf、tfl-dt2-bsr、tfl-dt1-f0和tfl-dt2-r0，tfl-dt1-bsf序列如seq id no.9所示、tfl-dt2-bsr序列如seq id no.10所示、tfl-dt1-f0序列如seq id no.11所示、tfl-dt2-r0序列如seq id no.12所示。

15、上述的快速、定向创制早熟油菜的方法，其pcr反应的体系包括：25μl 2×rapidtaq master mix、2μl 10μm dt1-bsf、2μl 10μm dt2-bsr、2μl 0.5μm dt1-f0、2μl 0.5μmdt2-r0、2μl pcbc-dt1t2 质粒和15μl ddh2o；其中dt1-bsf为flc-dt1-bsf或tfl-dt1-bsf，dt2-bsr为flc-dt2-bsr或tfl-dt2-bsr，dt1-f0为flc-dt1-f0或tfl-dt1-f0，dt2-r0为flc-dt2-f0或tfl-dt2-f0。

16、上述pcr反应的程序为：预变性 95℃ 3min、变性 95℃ 15s、退火 63℃ 15s、延伸72℃ 15s、再延伸 72℃ 5min，其中变性、退火和延伸循环28次。

17、上述步骤（4）中受体品种为湘油15。

18、鉴定利用上述的方法创制的早熟油菜的引物对，所述引物对用于鉴定同时靶向9个bnaflc同源基因而创制的早熟油菜，包括分子标记flc_t1-f分别与bnaa02g00370d-r、bnaa10g22080d-r和bnac03g04170d-r组合的三对引物，其中flc_t1-f的核苷酸序列如seqid no.13所示、bnaa02g00370d-r的核苷酸序列如seq id no.14所示、bnaa10g22080d-r的核苷酸序列如seq id no.15所示、bnac03g04170d-r的核苷酸序列如seq id no.16所示。

19、鉴定利用上述的方法创制的早熟油菜的引物对，所述引物对用于鉴定同时靶向5个bnatfl同源基因而创制的早熟油菜，包括分子标记bnacnng10680d-f和bnacnng10680d-r，其中bnacnng10680d-f的核苷酸序列如seq id no.17所示、bnacnng10680d-r的核苷酸序列如seq id no.18所示。

20、本发明具有以下有益效果：

21、1、本技术通过一个载体同时定点靶向多个同源基因，由于甘蓝型油菜基因组信息和bnaflc和bnatfl家族成员数量限制，目前对油菜其基因功能的研究进展较缓，且缺少多个成员之间的相互效应分析。结合前人的研究，我们确定了甘蓝型油菜中的9个bnaflc同源基因（bnaa02g00370d、bnaa03g02820d、bnaa03g13630d、bnaa10g22080d、bnac02g00490d、bnac03g04170d、bnac03g16530d、bnac09g46540d、bnac09g46500d）和5个bnatfl同源基因(bnac03g01440d、bnac02g02900d、bnaanng00810d、bnaa10g26300d、bnacnng10680d)，通过clustalw(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)进行了序列比对并通过在线网站crispr-p v2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/crispr2)查询和选择能够同时靶向多个同源基因的靶序列，最终各确定了两个能够同时定点靶向9 个bnflc或5个bnatfl基因的19bp crispr 靶位点保守序列target1和target2，依托于phse401编辑载体构建质粒并通过农杆菌介导进行遗传转化。

22、2、通过基因编辑同时定向靶向多个bnaflc基因将促进油菜早熟，我们观察了t0代编辑植株及野生型植株的生长发育情况，发现在不经过春化处理的情况下野生型植株（wt）无法正常开花，而编辑植株（t0）则早花早熟；利用小孢子培养技术，我们获得并观察了t1代编辑植株及野生型植株的生长发育情况，同样的，编辑植株(t1)表现出早花表型。这表明通过基因编辑同时定向靶向多个bnaflc基因将促进油菜早熟。

23、3、bnatfl家族成员bnacnng10680d缺失促进油菜早花，我们对ｔ1代bnatfl编辑植株进行了二代测序分析， tfl1和tfl2两个株系各植株五个bnatfl同源基因均发生突变，其中bnacnng10680d完全缺失，相对于未编辑植株表现出早花的表型； tfl3和tfl4两个株系各植株除bnacnng10680d外均发生突变，而与未编辑植株比并未出现早花现象。这说明bnacnng10680d在tfl抑制甘蓝型油菜开花中起主要作用，bnatfl家族成员bnacnng10680d缺失促进油菜早花。

24、4、开发了新的分子标记，辅助选择早熟油菜，针对bnaflc或bnatfl编辑植株测序结果和早花表型，我们开发了新的分子标记，通过pcr技术及测序技术，辅助选择早熟油菜育种，加快育种进程。