一种检测禽流感病毒的生物传感器及检测方法和应用与流程

本发明属于生物检测分析领域，尤其涉及一种检测禽流感病毒的生物传感器及检测方法和应用。

背景技术：

1、本部分的陈述仅仅是提供了与本发明相关的背景技术信息，不必然构成在先技术。

2、禽流感病毒(aiv)是orthomyxoviridae病毒家族的一员，最初在许多不同品种的鸟类中传播，几十年来一直困扰家禽产业，造成数百万美元的损失。现在已经证实aiv也可以感染和传播给人类，这可能是由于病毒表面感染相关糖蛋白的变异。世界各地已发现超过二十个亚型的aiv，其中一些亚型具有高致病性，可以导致肺炎、呼吸衰竭甚至死亡。aiv感染的早期症状是非特异性的，通常是发热，容易导致漏诊和广泛传播。及时诊断往往面临早期感染病毒载量低的挑战，需要高度敏感的检测方法。此外，不同亚型的aiv表现出不同程度的致病性，但基因相似度高，这使得对高致病性亚型的选择性检测成为必要但具有挑战性的任务(doi：10.1016/j.talanta.2019.12013)。因此，迫切需要开发高度敏感和选择性的aiv检测方法，以进行早期诊断和抗病毒治疗。

3、目前公认的禽流感病毒(aiv)检测黄金标准是反转录聚合酶链反应(rt-pcr)、northernblotting和酶联免疫吸附试验(elisa)等。虽然这些方法在流感病毒检测中被广泛应用，但它们通常存在操作繁琐、重复性差和灵敏度低的问题。因此，为了实现早期诊断的实用性，更加方便和敏感的方法被开发，包括基于电化学、比色法、荧光和电化学发光等。特别是，感应耦合等离子体质谱(icp-ms)由于其卓越的质量分辨率和强大的抗干扰能力，具有巨大的生物分析潜力。与上述方法相比，icp-ms在目标生物分子检测过程中能够提供更准确可靠的信息。但是，为了在感染早期检测时检测极低水平的aiv，仍然需要进一步提高icp-ms检测的灵敏度。

4、基于dna树枝状结构的信号放大被认为是一种有前景的方法。dna树枝状结构的组装是一个自我持续的过程，多个双链底物被组装成具有众多侧枝的树枝状纳米结构。凭借其指数增长模式、显著的双链底物稳定性和在无酶过程的低干扰，dna树枝状结构的组装显示出巨大的潜力，成为一种非常有用的分子工具。虽然基于此原理可以对待测物进行信号放大，但是基于具体逻辑的不同，所表现出的探针特异性、灵敏度和选择性有较大差异。

技术实现思路

1、为克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种检测禽流感病毒的生物传感器及检测方法和应用；基于icp-ms和dna树枝状结构携带的银纳米颗粒标记的生物传感器系统，实现高效检测禽流感病毒，尤其是禽流感h5n1。本发明中，dna树枝状结构携带的银纳米颗粒标记将单一的目标信号转化为多个银纳米颗粒的信号，实现了显著的信号放大；同时，未与dna树枝状结构结合的银纳米颗粒通过磁分离被去除，确保了低背景信号。与传统的生物传感器相比，本发明提供的生物传感器在敏感性和选择性方面具有显著优势，为抗病毒治疗和疫情控制的潜在分析工具。

2、为实现上述目的，本发明的一个或多个实施例提供了如下技术方案：

3、本发明的第一方面，提供一种生物传感器，至少包括两个dsdna探针和两个ssdna探针；

4、所述dsdna探针包括目标捕获区和两个trigger区；

5、所述目标捕获区可特异性结合待检测物的核酸；

6、所述目标捕获区分为捕获区1、捕获区2和捕获区3；所述trigger区包括错配区和间隔区；

7、所述dsdna1的a链包括目标捕获区和两个重复排列的trigger区；

8、所述dsdna1的b链包括与a链的捕获区3和间隔区互补的序列。

9、本发明的具体实施方式中，所述dsdna2的a链包括一个trigger区、捕获区2和捕获区3；

10、所述dsdna2的b链包括与其a链的间隔区和捕获区3互补的序列。

11、本发明的具体实施方式中，所述ssdna能够分别靶向dsdna的b链。

12、本发明的具体实施方式中，所述生物传感器还包括链霉亲和素化的磁球、链霉亲和素化的agnps或链霉亲和素化的量子点sa-qd；

13、优选地，所述dsdna的a链5’末端修饰了生物素。

14、本发明中探针可根据待检测物的核酸合理替换捕获区，实现对更多疾病、病毒的检测；

15、本发明的具体实施方式中，所述待检测物为禽流感病毒h5n1时，所述dsdna1的a链、b链序列分别如seq id no.1-2所示；

16、优选地，所述dsdna2的a链、b链序列分别如seq id no.4-5所示；

17、优选地，所述ssdna1的序列如seq id no.3所示；所述ssdna2的序列如seq idno.6所示。

18、本发明的第二方面，提供第一方面所述的生物传感器在检查禽流感病毒中的应用；

19、所述禽流感病毒包括h5n1。

20、本发明的第三方面，提供一种检测禽流感病毒的方法，所述方法包括采用第一方面所述的生物传感器进行检测；

21、1)将待测物的核酸与mb-dsdna复合探针于室温下共孵育；

22、2)加入dsdna1、dsdna2、ssdna1和ssdna2进行信号扩大反应；

23、3)分离得到磁珠部分，然后与sa-agnps共孵育后用icp-ms系统检测；

24、或，分离得到磁珠部分，然后与sa-qds共孵育后用荧光分光光度仪检测；

25、或，将2)得到的产物行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)，染色后，使用uv成像系统进行检测。

26、本发明的具体实施方式中，所述mb-dsdna复合探针为：将sa-mb与dsdna1室温下旋转摇匀1.5-3h，在磁场下分离得到磁珠部分，用缓冲液冲洗获得；

27、优选地，dsdna1-a：dsdna1-b的浓度比为2.0:2.5；

28、优选地，所述dsdna1与sa-mb的体积比为40-60：1。

29、本发明的具体实施方式中，所述孵育时间为0.8-3h；

30、所述步骤2)中，dsdna1、dsdna2、ssdna1、ssdna2的浓度比为0.8-2：2.5-3.5：1-3：3-5；优选为1：3：2：4。

31、本发明的第四方面，提供第一方面所述生物传感器和/或第三方面所述的检测方法在禽流感病毒活性检测和/或筛选禽流感病毒相关药物中的应用；

32、所述禽流感病毒相关药物包括病毒抑制剂。

33、以上一个或多个技术方案存在以下有益效果：

34、1)本发明首次提出利用icp-ms和dna树枝状结构携带的银纳米颗粒标记对h5n1核酸片段进行超敏感检测；

35、2)本发明中通过银纳米颗粒结合dna扩增实现了显著的信号放大；同时，未与dna结合的银纳米颗粒通过磁分离被去除，确保了低背景信号。

36、3)本发明中利用ssdna探针封闭dsdna探针的一条链并暴露出具触发功能的trigger区，更有利于信号放大及检测特异性提高。

37、4)本发明中生物传感器还表现出良好的选择性，对有效实现单碱基突变检测，为敏感、准确和稳定的禽流感病毒检测提供了一种有前景的方法，将成为抗病毒治疗和疫情控制的潜在分析工具。

38、本发明附加方面的优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。